Механизмы разобщения дыхания в митохондриях сердца при развитии стрептозотоцин-индуцированного диабета на фоне экспериментального инфаркта

В настоящее время сахарный диабет в связи с серьезными метаболическими изменениями рассматривается как фактор, осложняющий течение хронической сердечной недостаточности [1, 7, 10, 14]. При недостаточном кровоснабжении или диабете функциональные расстройства в миокарде связаны с накоплением токсичных промежуточных продуктов окисления [10, 14], стимулирующих неспецифическую проницаемость мембран и разобщение окислительного фосфорилирования [6, 8, 13, 14].

При увеличении активных форм кислорода (АФК) и накоплении ионов кальция разобщение окислительного фосфорилирования с участием свободных жирных кислот (СЖК) может быть обусловлено формированием и открытием митохондриальной Са2+-чувствительной неспецифической поры (МНП) [6, 13, 15].

В экстремальных природных условиях (гипоксия, гипо- и гипертермия и др.) повышенная проницаемость внутренней мембраны митохондрий и супрессия системы окислительного фосфорилирования являются временными и носят защитно-приспособительный характер [9]. Увеличение содержания триглицеридов в миокарде, изменение интенсивности окисления СЖК и индуциро- ванное ими разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца в современной литературе рассматриваются и с позиции защиты миокарда от накопления вредных продуктов обмена в ткани сердца при сердечной недостаточности и сахарном диабете [10, 14]. Вероятно, этот механизм может участвовать в развитии ишемической резистентности миокарда у взрослых животных с небольшим сроком стрептозотоцин-индуциро-ванного диабета [3, 12].

Цель исследования: оценить защитное действие различных механизмов разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях, протекающих c участием СЖК, при развитии ишемического и диабетического повреждения миокарда.

Материал и методы

Исследования выполнены на половозрелых крысах-самцах (250–300 г) линии Вистар. Для моделирования инфаркта миокарда (И) животным под эфирным наркозом осуществляли перевязку левой передней нисходящей коронарной артерии [5]. Развитие постинфарктных изменений верифицировали морфологически. Гипертрофию миокарда определяли по соотношению массы сердца к массе тела и массы левого желудочка к массе сердца, как описано ранее [4, 5].

Сахарный диабет (Д) индуцировали однократным введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно, разведенного 0,01 моль/л цитратным буфером (рН 4,5) [3]. Верификацию Д осуществляли по увеличению концентрации глюкозы в крови крыс в 3– 4,5 раза, снижению массы тела, развитию полиурии и полидипсии [4].

Было сформировано 5 экспериментальных групп животных: I группа – контроль – интактные животные; II группа – животные после моделирования инфаркта миокарда (И); III группа – животные с индуцированным сахарным диабетом (Д); IV группа – постинфарктные животные со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (И+Д); V группа – животные, у которых после индукции сахарного диабета моделировали инфаркт миокарда (Д+И) (табл. 1). В каждой группе выделены подгруппы соответственно срокам после моделирования рассматриваемых состояний – через 2, 4 и 6 недель (табл. 1).

По причине высокой смертности животных в V экспериментальной модели образовано только две подгруппы животных (табл. 1).

Митохондрии (МХ) из миокарда животных получали стандартным методом дифференциального центрифугирования в сахарозной среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES, рН 7,4 [4]. До исследования митохондрии суспендировали и хранили в среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES, рН 7,4.

Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически, с помощью электрода Кларка. Измерение проводили в среде (рН 7,4), содержащей: 300 мМ сахарозу, 10 мМ КСl, 5 мМ КН2РО4, 1,2 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ сукцинат, 2 мкМ ротенон, 5 мМ HEPES. Добавки: олигомицин (олиго), ингибитор протонного канала АТФ-синтетазы, 2 мкг/мл+200 мкМ АДФ; А23187, Ca2+-ионофор, 0,2 мкг/мл+1 мМ ЭГТА; карбокси-атрактилат (кАтр), ингибитор АТФ/АДФ-антипортера, 2 мкМ; циклоспорин А (циклоА), ингибитор МНП-поры, 2 мкг/мл. В работе использовали реактивы фирмы MP Biomedicals, Sigma и ICN (USA).

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Значения исследуемых показателей представлены в виде средних значений±стандартная ошибка среднего (M±m). Распределение величин исследуемых параметров не соответствовало закону нормального распределения (критерий Шапиро–Вилка; р>0,05). Статистическую значимость различий исследуемых параметров между сравниваемыми группами оценивали непараметрическим ранговым U-критерием Манна–Уитни, внутри групп – критерием Вилкоксона для зависимых переменных. За уровень статистической значимости принимали p<0,05.

Результаты и обсуждение

В нашем исследовании АДФ (в присутствии олигоми-цина) и кАтр снижали скорость потребления кислорода МХ во всех экспериментальных группах (табл. 2). Это наблюдение согласуется с данными о том, что кАтр или АДФ (как субстрат АТФ/АДФ-антипортера) могут ингибировать протонофорное действие СЖК [6, 8]. Отсюда можно предположить, что при рассматриваемых патологиях и их сочетании увеличение скорости потребления кислорода обусловлено именно протонофорным действием СЖК.

Однако следует отметить, что в подгруппах сочетанной патологии И2Д6, И4Д6, И6Д6 и Д2И4 на отдаленных сроках развития реакция на кАтр и/или АДФ была слабо выражена. Возможно, что такой результат обусловлен перемещением СЖК к аспартат/глутаматному антипортеру под влиянием кАтр. Действительно, в исследовании [8] показано, что АДФ/АТФ- и аспартат/глутаматный антипортеры могут функционировать совместно как разобщающий комплекс с общим пулом СЖК.

С другой стороны, известно, что протонофорное действие СЖК зависит от интенсивности формирования АФК [6, 8, 13]. Так, в присутствии антиоксидантов разобщающая активность пальмитата приблизительно на 80% подавляется АДФ [8]. Соответственно, сохраненная реакция на АДФ свидетельствует о высокой активности антиоксидантных систем в митохондриях, а уменьшение реакции на АДФ – по мере развития рассматриваемых патологий – может быть следствием истощения их антиоксидантных возможностей.

Кроме того, СЖК, наряду с представленным выше механизмом, могут оказывать разобщающее действие на окислительное фосфорилирование более радикальным путем – с участием МНП [2, 6, 13, 15]. В нашем исследовании ингибирование МНП добавлением в среду инкубации циклоА приводило к статистически значимому подавлению дыхания митохондрий в группах животных с монопатологиями (табл. 2). При сочетанных патологиях ингибирующее действие циклоА проявлялось не во всех группах, а именно, отсутствовало в подгруппах И4Д2–Д6 (IV группа) и Д2И2–4 (V группа) (табл. 2). Следует отметить, что в подгруппе И4Д2-6 отсутствовала реакция не только на циклоА, но и на кАтр, а нарастание Vсукцинат при этом было наиболее медленным в сравнении с остальными экспериментальными группами (табл. 2). Возможно, это объясняется некоторой стабилизацией морфофункциональных показателей в рассматриваемые сроки сочетанной патологии [4]. C другой стороны, отсутствие реакции на используемые нами ингибиторы в данных группах могло быть обусловлено включением других механизмов разобщения окислительного фосфорилирования. Например, СЖК способны формировать циклоА-нечувствительные поры [2]. Разобщающее действие СЖК может осуществляться и c участием UCP-белков [6, 13, 14]. Подавление дыхания при рассматриваемых патологиях, как показано в нашей предыдущей работе, может быть обусловлено ингибированием митохондриальной фосфолипазы А2 [12]. Нельзя исключать и того, что разнообразие ответных реакций на супрессоры дыхания митохондрий с участием СЖК в рассматриваемых подгруппах обусловлено одновременным включением разных механизмов разобщения.

Важно отметить, что все перечисленные выше механизмы разобщения являются кальций-чувствительными

Таблица 1

Структура групп экспериментальных животных

Экспериментальные группы и подгруппы	Время между моделированием первой и второй патологии (недели)	Время после моделирования второй патологии до вывода животного из эксперимента (недели)	Общая длительность патологии (недели)	Число крыс в группе (n)
I группа – контроль				10
II группа – инфаркт (И2–И6):
И2	2	-	2	9
И4	4	-	4	6
И6	6	-	6	10
III группа – диабет (Д2–Д6):
Д2	2	-	2	5
Д4	4	-	4	5
Д6	6	-	6	12
IV группа – инфаркт+диабет (И+Д):
И2Д2	2	2	4	6
И2Д4	2	4	6	5
И2Д6	2	6	8	5
И4Д2	4	2	6	7
И4Д4	4	4	8	7
И4Д6	4	6	10	5
И6Д2	6	2	8	5
И6Д4	6	4	10	5
И6Д6	6	6	12	14
V группа – диабет+инфаркт (Д+И):
Д2И2	2	2	4	5
Д2И4	2	4	6	5

Таблица 2

Влияние различных супрессоров дыхания на скорость поглощения кислорода митохондриями сердца экспериментальных животных

Группы	V сукцинат	Добавки
		+кАтр	+олиго+АДФ	+циклоА	+ЭГТА+А23187
I группа	26,5±1,9	28,8±4,5	26,3±2,5	24,0±2,0	25,9±4,2
II группа: И2	76,0±1,9*	31,4±1,9#	44,2±4,2#	34,1±1,7#	24,3±2,2#
И4	78,3±6,2*	52,5±2,9#	56,3±2,5#	39,0±2,0#	31,4±3,9#
И6	126±3,4*	75,9 ±3,5#	72,5±6,3#	91,4±4,1#	56,5±4,9#
III группа: Д2	92,3±5,8*	89,8±3,9	33,3±3,2#	63,5±5,3#	29,0±4,2#
Д4	135±3,9*	129 ±6,2	71,6±3,5#	103±9,8#	97,9±9,9#
Д6	156±5,4*	129±8,3	91,1±2,7#	106±9,1#	99,2±6,7#
IV группа: И2Д2	65,4±2,5*	31,6±3,3 #	36,6±2,6#	35,6±1,6#	26,1±2,5#
И2Д4	138±3,4*	83,6±3,9#	80,3±5,7#	99,2±6,4#	45,4±4,4#
И2Д6	158±14,1*	135±11,9	122±9,8#	116±12,0#	61,8±4,8#
И4Д2	78,6±5,2*	69,8 ±4,4	54,1±3,7#	68,8 ±5,2	49,9±4,9#
И4Д4	91,0±3,4*	89,2 ±3,7	58,9±2,1#	86,3±3,9	55,8±3,4#
И4Д6	110±4,1*	86,9±9,9	99,8±5,4	114 ±2,8	64,1±2,5#
И6Д2	87,3±4,4*	62,1±5,2#	54,4±3,2#	61,2±4,6#	32,1±5,7 #
И6Д4	135±9,4*	79,4±4,3#	62,4±3,2#	87,1±3,8#	46,1±4,3#
И6Д6	167±8,2*	143±7,2	129±6,2#	123±6,4#	65,6±4,8#
V группа: Д2И2	79,9±1,7*	56,9±6,2#	56,2±5,2#	73,2±3,6	50,6±7,9#
Д2И4	117±7,7*	72,1±7,5#	97,5±6,8	93,6±4,7	69,1±6,6#

Примечание: Vсукцинат – дыхание МХ при окислении сукцината; +кАтр, +олиго+АДФ, +циклоА, +ЭГТА+А23187 – дыхание МХ при введении в среду инкубации соответствующих добавок (см. Материал и методы); * – различия в колонке Vсукцинат статистически значимы (p<0,05) при сравнении с этим показателем в I группе; # – различия по дыханию МХ в каждой экспериментальной группе статистически значимы (p<0,05) при сравнении с показателем Vсукцинат в этой же группе.

• [11 ]. Хорошо известно, что сочетание ЭГТА с А23187 приводит к уменьшению пула ионов кальция в митохондриях. В нашем исследовании в подобных условиях наблюдалось выраженное подавление свободного дыхания при всех рассматриваемых монопатологиях и их сочетаниях. В то же время в контрольной группе ЭГТА и А23187 в используемых концентрациях не оказывали значительного влияния на дыхание митохондрий. По нашим данным, на ранних стадиях развития патологий (подгруппы И2, Д2, а также И2Д2) использование ЭГТА+А23187 снижало скорость поглощения кислорода митохондриями миокарда практически до уровня контрольной группы. Выраженность ингибирующего влияния ЭГТА+А23187 на дыхание митохондрий во всех экспериментальных группах оказалась более значима, нежели действие других использованных нами супрессоров дыхания.

Такая чувствительность митохондрий к изменению внутримитохондриальной концентрации Са2+ является свидетельством обратимости процесса разобщения окислительного фосфорилирования во всех случаях, в том числе при формировании и открытии МНП. При физиологических условиях МНП функционирует в низкопро-водящем состоянии, пропускает протоны, ионы калия и кальция, открывается кратковременно и закрывается – при изменении рН матрикса митохондрий [15]. Избыточное накопление кальция и насыщение Са2+-сенсоров поры приводит к открытию поры в высокопроводящем состоянии, когда в матрикс митохондрий начинают проникать растворенные вещества массой до 1,5 кДа. Происходит выравнивание всех градиентов, набухание митохондрий, разворачивание крист, разрыв внешней мембраны и высвобождение факторов, запускающих гибель клетки по типу апоптоза или некроза [2, 6, 15].

Заключение

Разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях кардиомиоцитов при рассматриваемых патологиях направлено на предотвращение накопления активных форм кислорода и выполняет защитную функцию.

Разобщение окислительного фосфорилирования носит неспецифический характер и реализуется с одновременным включением как минимум двух механизмов: с участием АДФ/АТФ-антипортера и митохондриальной циклоспорин-чувствительной поры.

На ранних стадиях развития сочетанной патологии – как в случае инфаркт+диабета, так и диабет+инфаркта, – преимущественный вклад в разобщение окислительного фосфорилирования вносит процесс с участием АТФ/АДФ-и, возможно, аспартат/глутаматного антипортеров с постепенным включением и преобладанием на поздних стадиях механизма с участием митохондриальной цик-лоспорин-чувствительной поры.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной целевой научно-технической программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-техническо- го комплекса России на 2007–2012 гг.” (Государственный контракт № 02.527.11.0007 от 30 апреля 2009 г.)