Меланофоры рыб в реализации свободнорадикальных клеточно-тканевых механизмов онкогенеза

В настоящее время не вызывает сомнений, что клетки, синтезирующие пигменты в различных тканевых компартментах, обеспечивают реализацию важнейших физиологических процессов у позвоночных и беспозвоночных животных, растений и грибов [1]. По мере расширения имеющихся представлений о биологической роли пигментов становится совершенно очевидным их важное участие в реализации активности всех без исключения функциональных систем организма. Целесообразность существования огромного многообразия окрасок покровов тела рыб остается до настоящего времени одним из не решенных вопросов [9]. Результаты, полученные С. Ю. Петуховым и Ю. П. Толмачевым (2015), Д. В. Праздниковым и Ф. Н. Шкилем (2018) весьма убедительно объясняют причины и значение возникающих межвидовых и внутривидовых различий окраски тела отдельных групп рыб и особенности их преобразований в филогенезе [10-11]. Эти материалы имеют важное значение для понимания фундаментальных закономерностей биологии и экологии водных животных. Однако использование современных методов исследований позволило сместить акцент работ в направлении изучения различных классов пигментов с популяционно-видового и онтогенетического, до клеточного и молекулярно-генетического уровней организации живой системы. Такой подход позволил приблизиться к пониманию значения пигмент-синтезирующих клеток в реализации морфофункциональных преобразований в организме водных животных уже на ранних этапах онтогенеза, начиная от оплодотворения икры, периоды эмбрионально-личиночного развития и более поздние сроки онтогенеза [4]. Сведения по данной проблематике, накопленные в результате наблюдений на различных видах живых организмов, указывают на способность пигментных клеток     посредством     экспрессии специфических белков   обеспечивать осуществление гораздо более важных, чем предполагалось ранее морфогенетических преобразований, как в норме, так и при изменении параметров среды обитания рыб или воздействии на организм патогенов [3].

Считается,  что синтензирующие меланин клетки  у различных живых организмов принимают активное участие в окислительно-восстановительных процессах и регуляции редокс-гомеостаза как в норме, так патологии [14]. Анализ публикаций отечественных и зарубежных авторов     указывает    на    крайне недостаточную информации относительно участия хроматофор рыб в реализации клеточных и органно-тканевых механизмов адаптации к действию повреждающих факторов [4]. В этой связи изучение значения меланофоров рыб в реализации свободнорадикальных клеточно-тканевых механизмов онкогенеза определяет высокую    актуальность    настоящего исследования.

Целью работы являлось изучение роли меланофоров у рыб вида серебряный карась ( Саrаssius gibеliо ) в морфогенезе опухолевого роста покровного эпителия.

Материал и методы исследований. Исследование проводилось в период октября 2020 – март 2021 гг. на 32 особях рыб серебряного карася ( Саrаssius gibеliо ) средней массой 1431, 41±12 граммов. Рыбы добыты из экологически депрессивного водоема с высоким уровнем антропогенной нагрузки [5]. Объектом изучения являлись участки неопластических образований, локализованных в области костей жаберной крышки, которые забирали единым комплексом. Материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и далее декальцинировали в насыщенном растворе трилона Б. При вырезке патологического материала соблюдали предельную осторожность и сохраняли целостность тканевого комплекса, включающего костную ткань и зоны опухолевого роста. Образцы обезвоживали в изопропиловом спирте и заливали в гистомикс по стандартной методике. Срезы толщиной 510 мкм готовили на ротационном полуавтоматическом микротоме SLEE CUT 5062 (Германия), а затем окрашивали гематоксилином Бемера и эозином. Распределение суммарных кислых гликозаминогликанов (ГАГ) изучали путем постановки гистохимической реакции с альциановым синим по Стидмену. Реакцию на коллаген определяли по Маллори.

Исследование гистологических препаратов осуществляли с использованием комплекса оптикоструктурного анализа Axio Imager.M2 c программным обеспечением для анализа изображений AxioVision Z2 M2 (CARL ZEISS, Германия). Цифровая обработка материала осуществлялась при помощи CCD-камеры AxioCam HR c программным обеспечением Zen Lite (CARL ZEISS, Германия).

Содержание первичных и вторичных продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ), активность ключевых ферментов системы антиоксидантной защиты (АОЗ) изучали в рекомендации Е. Б. Меньщиковой с соавт. (2006) [8]. Уровень диеновых конъюгатов (ДК) определяли в реакции с гептанизопропаноловой смесью. Содержание малонового диальдегида (МДА) исследовали в реакции с трихлоруксусной и 2-тиобарбитуровой кислотами. Активность каталазы (КАТ) выявляли в реакции перекиси водорода с добавлением молибдата аммония. Активность супероксидисмутазы (СОД) определяли по ингибированию скорости восстановления тетразолия нитросинего в системе феназинметасульфата и НАД∙Н. [7]. Статистическую обработку результатов исследования проводили на основе вычисления средних величин (M) и их ошибок (m) с учетом объема выборки (n). Различия всех исследуемых показателей оценивали методом вариационной статистики по t-критерию Стьюдента и считали достоверными при Р ≤ 0,05. Все расчеты проводили по общепринятым формулам с использованием пакета программ Miсrosoft Excel 2010.

Результаты исследований. По уровню развития патологического процесса в области жаберных крышек карася обнаружены особи, как с незначительными, так и чрезмерно развитыми по площади новообразованиями. В случае слабо выраженного патологического процесса измененная ткань имеет площадь до 11,31±1,98 см3 (Рисунок 1 А). Ее поверхность преимущественно гладкая или слегка бугристая, бледно-розового или серого цвета. Морфология патологических образований представлена паренхимой в форме многочисленных эпителиальных разрастаний сферической формы и стромой (Рисунок 1 Б.) На светооптическом уровне паренхима состоит из активно пролиферирующих клеток многослойного плоского эпителия (Рисунок 1 В). В структуре ткани заметны очаговые пигментные образования чернозеленого цвета (рис 1 А). В зависимости от выраженности процесса морфологическая картина измененной ткани покровного эпителия жаберной крышки соответствует либо гиперплазии, либо слабовыраженной дисплазии. Морфологические критерии дисплазии в данном случае основываются на наличие трех основных диагностических признаков – клеточная атипия, нарушение дифференцировки клеток эпителия и, в целом дезорганизация структуры покровного эпителия жаберной крышки (Рисунок 1 Г).

Рисунок 1 – А. Звездочкой обозначено новообразование, стрелками – участки гиперпигментации новообразования; Б. Звездочками обозначены эпителиальные узелки новообразования, стрелкой – строма новообразования, головками стрелок – кровеносные сосуды; В. Звездочками обозначены участки активно-пролиферирующих клеток многослойного плоского эпителия; Г. Стрелками обозначены участки дезорганизации покровного эпителия жаберной крышки; Д, Е. Звездочками обозначены кровеносные сосуды, стрелками – положительная реакция цитоплазмы кератиноцитов на кислые ГАГ, головками стрелок – локализация меланофоров

Наличие многочисленных межклеточных щелей, вероятно, обусловлено потерей или снижением темпов экспрессии интенсивно пролиферирующими клетками эпителия молекул адгезии и замедлением времени формирования межклеточных контактов.

Строма патологического образования обильно васкуляризирована (Рисунок 1 Б, Е, Д). В просвете кровеносных сосудов и периваскулярном пространстве идентифицируются многочисленные лейкоциты, среди которых преобладают клетки лимфоцитарного профиля. На препаратах, окрашенных альциановым синим, отчетливо видны многочисленные активно пролиферирующие кератиноциты, цитоплазма которых дает положительную реакцию на ГАГ (Рисунок 1 Д). В межклеточном веществе стромы заметно обилие меланофоров, локализованных в области формирования кровеносных капилляров (Рисунок 1 Д, Е).

При наличии у обследованных рыб обширных новообразований в области костей жаберной крышки последние имеют бугристую поверхность темнозеленого или черного цвета неправильной формы с нечеткими контурами.

Дезорганизация эпителия новообразования по уровню атипии клеток и их дифференцировки отличается вариабельностью структурнофункциональных преобразований. Одни имеют схожее строение с описанной выше тканью рыб, у которых патологический процесс ограничен гиперплазией и начальными этапами дисплазии. В исследуемых образцах рыб с массивными новообразованиями морфологическая картина эпителия имеет признаки глубокого нарушения структурной организации. Неоплазма возвышается над поверхностью жаберной крышки и ее размеры варьируют от 11,31±1,98 см3 и до 33,15 см3 (Рисунок 2 А). На светооптическом уровне опухоль состоит из множества сосочков, что само по себе является проявлением атипизма ткани (Рисунок 2 Б).

На обзорных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, отчетливо заметно, что клетки базального слоя теряют характерное для нормального эпителия     строение.     Вытянутые, призматической формы эпителиоциты выстраиваются         перпендикулярно базальной мембране и между клетками становятся     заметными     широкие межклеточные щели (Рисунок 2 В). Среди эпителиоцитов, лежащих выше базального слоя, заметны фигуры атипического митоза, клетки с признаками летального повреждения. В структуре эпителия отдельных сосочков обнаруживается фрагментация базальной мембраны и нарушение стратификации эпителия (Рисунок 2 Г, Д). Кроме того, обращает внимание наличие многочисленных кератиноцитов      с      оксифильной цитоплазмой и участками ее просветления в околоядерной зоне (Рисунок 2 Е).

В центре эпителиального сосочка видны обширные полости, содержащие клеточный детрит и субстрат, по тинкториальным              свойствам напоминающий меланин или липофусцин (Рисунок 3 А). Клеток воспаления в таких образованиях и на их периферии не обнаружено. На поверхности сосочка эпителий имеет признаки гиперкератоза (Рисунок 3 Б).

Применение     гистохимической реакции на ГАГ и коллаген удачно демонстрирует возможность реализации дифференциального патоморфологического    подхода    к идентификации              структуры новообразования.    В    реакции    с альциановым синим среди клеточного состава эпителия заметно высокое содержание эпителиоцитов, синтезирующих слизистый секрет. В структуре опухоли паренхима преобладает строму по объему, коллагеновые фибриллы которой интенсивно окрашиваются в реакции по Маллори (Рисунок 3 В). Строма образована типичной рыхловолокнистой соединительной тканью с развитой сетью кровеносных сосудов. Капилляры чрезмерно расширены. В просвете кровеносных сосудов и периваскулярном пространстве идентифицируется высокое содержание лимфоцитов (Рисунок 3 Г). По ходу капиллярной сети периваскулярно располагаются многочисленные меланофоры (Рисунок 3 Д). Изменение тинкториальных свойств патологически измененного покровного эпителия и костной ткани в области os paraeoperculum и os operculum, указывает на чрезмерное увеличение темпов ремоделирования костного матрикса и повышение порозности костей жаберной крышки (Рисунок 3 Е).

Рисунок 2 – А. Звездочкой обозначено новообразование; Б. Звездочками обозначены эпителиальные узелки новообразования; В. Стрелками обозначены межклеточные щели; Г. Головками стрелок обозначено нарушение целостности базальной мембраны, стрелками – фигуры атипического митоза, звездочками – клетки с признаками летального повреждения; Д. Головками стрелок обозначено нарушение целостности базальной мембраны; Е. Головками стрелок обозначены клетки с оксифильной цитоплазмой и участками её просветления в околоядерной зоне, стрелками – фигуры атипического митоза

Рисунок 3 – А. Стрелками обозначены локализация клеточного детрита в центре эпителиального сосочка; Б. Звездочкой отмечен участок гиперкератоза в структуре эпителия; В. Стрелками обозначена интенсивная реакция на коллаген; Г. Звездочками обозначена локализация лимфоцитов в просвете кровеносных сосудов стромы; Д. Стрелками обозначена локализация меланофоров; Е. Стрелками обозначены участки остеолиза костного матрикса

При изучении состояния системы АОЗ в гомогенатах ткани опухоли нами установлена депрессия ключевых ферментов системы антоксидантной защиты СОД, КАТ и превышение уровня ДК и МДА по сравнению с интактными участками эпителия жаберной крышки карася (Таблица 1).

Оценивая полученные результаты, с позиции единства структуры и функции, закономерно возникает вопрос относительно природы данного патологического образования в области жаберной крышки карася. На ранних этапах развития процесса в структуре эпителия опухолевого образования рыб пролиферация клеток эпителия происходит без нарушения целостности базальной мембраны и структуры эпителиального пласта в целом. По мере дальнейшего развития патологического процесса в цитоплазме клеток обнаруживается не характерное для нормы усиление реакции на ГАГ. Структура такого эпителия напоминает муцинпродуцирующее интраэпителиальное поражение шейки матки у человека SMILE (stratified mucin – producing intraepithelial lesion) при инфицировании вирусом папилломы человека (ВПЧ). В публикации J. J. Park с соавторами (2000) приводится мнение, что поражение мультипотентной стволовой клетки эпителиального пласта ВПЧ приводит к развитию гиперплазии, плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии и малигнизации in situ [12]. В нашем исследовании на причастность к неопластическому процессу вирусного патогена указывает наличие среди клеток эпителия жаберной крышки кератиноцитов с зоной просветления цитоплазмы в околоядерной зоне, которые напоминают койлоциты – клетки инфицированные ВПЧ.

Таблица 1 – Показатели липопероксидации и активности системы антиоксидантной защиты в гомогенатах эпителиальной ткани жаберной крышки карася

Исследуемые показатели	Локализация
	эпителий интактных участков	эпителиома
ДК, нмоль/г	4,47±0,27	25,11±1,46 *
МДА, нмоль/г белка	32,93±6,35	205,41±15,80*
КАТ, моль/мин/мг белка	11,22±0,91	1,47±0,29 **
СОД, усл. ед./ мг белка	1,47±0,34	0,32±0,13*

Примечание. Различия статистически достоверны между показателями образцов интактных участков жаберной крышки и эпителиомы, *Р≤0,05, **Р≤0,01

В структуре эпителиальных узлов отмечаются признаки избыточного ороговения в виде интенсивно оксифильных концентрических образований, которые дают картину плоскоклеточного ороговевающего рака. Описанные особенности гистотопографии тканевого комплекса в строме патологического образования карася свидетельствуют о существовании причинно-следственной связи между функциональной активностью меланофоров и повреждением кератиноцитов, предположительно NO.

Опираясь на собственные результаты и данные литературных источников инфицирование покровного эпителия вирусным патогеном начинается с клеток базального слоя. В случае вирусного папилломатоза, например, человека инфицирование происходит в результате травмы глубоких слоев эпителия слизистой оболочки. В нашей работе наличие в сосудах стромы опухоли, расположенных на границе с базальным слоем эпителия высокого содержания лимфоцитов, которые, как известно, принимают активное участие в механизмах противовирусной защиты клеток не исключает возможности проникновения вируса гематогенным путем. Предпринятый ранее нами патоморфологический анализ образцов печени, почек, кишечника и жабер рыб с опухолевыми образованиями не позволил выявить характерных признаков их повреждения. Следовательно, в рамках настоящей работы без проведения специальных исследований однозначно ответить на этот вопрос не представляется возможным. Вместе с тем, факт активной пролиферации кератиноцитов является стереотипной реакцией клеток на их сублетальное повреждение. В зависимости от тяжести процесса морфологическая картина повреждения развивается в направлении от гиперплазии эпителия к дисплазии и очаговой малигнизации. По мнению C. Romero-Graillet с соавторами (1997) пролиферирующие кератиноциты экспрессируют паракринные факторы, активирующие пролиферацию муцинсекретирующих клеток. Данные литературы и результаты иммуногистохимии свидетельствуют об участии кератиноцитов и меланофор в синтезе NO [13].

С точки зрения функциональной морфологии повышение количества меланисинтезирующих клеток в опухолевой ткани имеет дуалистическую природу. С одной стороны, рост опухоли требует ее адекватного кровоснабжения. В этом плане экспрессия меланофорами NO обеспечивает активный рост сосудов в строме неоплазмы. С другой стороны, биологический смысл увеличения меланофор связан со способностью свободнорадикальной молекулы NO повреждать инфицированные вирусным патогеном клетки эпителия. Анализ состояния активности свободнорадикальных процессов в опухолевой ткани карася подтверждает наличие высокого уровня окислительных процессов и развитие окислительного стресса (Таблица 1).

Необходимо отметить, что у более низко организованных животных, например, насекомых меланин участвует в инкапсуляции проникшего в организм патогена и заживление ран [5]. При таком варианте в ходе инкапсуляции чужеродный объект заключается в капсулу из разрушенных и меланизированных клеток. Подобную реакцию можно наблюдать при ранении мягких тканей тела насекомого, где меланин выступает в качестве мощного механического барьера, изолирующего чужеродные объекты, предотвращающий рост паразитов и ингибирующий микробиальные хитиназы и протеазы [6, 15]. Кроме того, во время каскада ферментативных реакций, приводящих к образованию меланина, возникает также ряд промежуточных высокореактивных продуктов, опосредующих киллерный механизм при инкапсуляции и гранулообразовании.

Считается, что меланины, особенно эумеланины, демонстрируют выраженные окислительно-восстановительные свойства и могут принимать участие в одноэлектронных и двухэлектронных окислительно-восстановительных реакциях, приводящих к генерации супероксидных радикалов. Последние, как известно, способствуют необратимому повреждению молекулы ДНК, летальному повреждению клеток и субклеточных структур, развитию опухолевого процесса [2].

Заключение. Таким образом, результаты исследования дают все основания считать, что в основе молекулярных механизмов развития опухолевого процесса у рыб важная роль принадлежит   активным метаболитам кислорода, а меланин синтезирующие клетки выступают в роли клеточнотканевых регуляторов онкогенеза.