Метаболические параметры и интенсивность метанообразования в рубцовой жидкости in vitro при тестировании рационов с добавками растительных препаратов и CoCl2

Исследование проводилось при финансовой поддержке гранта РНФ ¹21-76-10014.

Возникновение бактериальной резистентности и отказ от использования кормовых антибиотиков в качестве стимуляторов роста (1) привели к необходимости поиска их естественных и безопасных альтернатив, таких как пробиотики, пребиотики, минеральные компоненты или фитобиотики (2, 3).

В результате вторичного метаболизма растения производят разнообразные органические соединения, которые могут быть полезны для животных. Показано, что фитобиотики проявляют высокую биологическую активность. Они были исследованы в качестве модификаторов функций рубца у жвачных (4-6). Так, добавление смеси растительных экстрактов положительно влияло на ферментацию в рубце и показатели роста у быков, потреблявших большое количество кормовых концентратов (7). В другом исследовании (8) было выявлено позитивное влияние неомицина и листьев душицы на тяжесть течения заболеваний желудочно-кишечного тракта, а также смертность новорожденных телят.

Установлено, что растения и содержащиеся в них биологически активные соединения с антимикробными свойствами способствуют улучшению использования корма и повышению продуктивности животных за счет изменения микробной ферментации в рубце (9). Однако в настоящее время растительные продукты используются в кормовой промышленности в основном в качестве добавок, ароматизаторов и веществ, возбуждающих аппетит (10). Несмотря на множество исследований, проведенных в основном in vitro и посвященных потенциальному применению фитобиотиков (6, 7), мало информации об их использовании в композиции с другими веществами с целью улучшения обменных процессов и стимуляции роста.

Ранее в экспериментах in vitro мы протестировали фитопрепараты Salviae folia , Inulae rhizomata et radices , Artemisiae absinthil herba , Scutellaria baicalensis , Origanum vulgare и отобрали образцы, показавшие наибольшую функциональную активность, — листья шалфея и траву полыни (11). Биологически активные вещества, входящие в состав растительных препаратов, такие как алкалоиды, флавоноиды, сапонины, дубильные вещества, фенольные соединения, терпеноиды и эфирные масла, оптимизируют белковый метаболизм, уменьшают выработку метана и снижают ацидоз, что в конечном итоге улучшает ферментацию в рубце (12). Для коррекции влияния растительных препаратов на метанообразование и ферментацию в рубце необходимо изучить эффективность использования их композиций с химическими элементами.

Кобальт рассматривается как перспективный химический элемент, поскольку он важен для микробной популяции в рубце жвачных, в частности для целлюлозолитических микроорганизмов. Кроме того, выработка жизненно важного для организма-хозяина и простейших витамина В 12 повышается с увеличением количества кобальта, доступного при бактериальном синтезе (13-15). Известно также, что смесь эфирных растительных ингредиентов и органического кобальта у мелких жвачных (16) способствовала снижению образования метана и аммиака в рубце и улучшению ферментации, а форма и количество кобальта оказывали токсическое действие на численность метаногенных бактерий (17).

В настоящей работе впервые описаны изменения метаболических параметров в рубцовой жидкости in vitro в условиях, когда к образцам рационов (биосубстратам) добавляли фитопрепараты и хлорид кобальта, определены наиболее эффективные сочетания и дозировки этих добавок. При использовании комплекса Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ) и CoCl2 (1,5 мг/кг СВ) было установлено повышение переваримости сухого вещества, увеличение активности пищеварительных ферментов и содержания метаболитов в рубцовой жидкости, а также снижение образования метана. Использование комплекса Salviae folia (1,6 г/кг СВ) и CoCl2 (1,5 мг/кг СВ) привело к максимальному снижению образования метана.

Цель работы — изучить влияние растительных препаратов и хлорида кобальта (отдельно и в сочетании друг с другом) на изменение метаболических параметров в рубцовой жидкости бычков методом in vitro.

Методика. Опыты проводили в 2021 году в ЦКП БСТ РАН (г. Оренбург). Материал для исследования получали от бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы ( N = 4), средней массой 250-265 кг в возрасте 9-10 мес. Животных содержали индивидуально, на привязи, в типовых клетках, доступ к воде не ограничивали, кормление осуществляли 2 раза в сутки. Кормление подопытных животных было организовано с учетом рекомендаций А.П. Калашникова с соавт. (18).

Рубцовую жидкость (РЖ) отбирали спустя 12 ч после кормления, через хроническую фистулу рубца (d = 80 мм; «Ankom Technology Corp.», США) резиновым шлангом (наружный диаметр 40 мм) в термос объемом 3 л. Транспортировку осуществляли при 4-8 °С в течении 20-30 мин. РЖ, предварительно подогретую до 39 °С, использовали сразу по прибытии в лабораторию.

Исследования проводили in vitro c помощью инкубатора Ankom DaisyII («Ankom Technology Corp.», США) по специальной методике (19, 20). Перед использованием пробы РЖ фильтровали через 4 слоя марли и смешивали с буферным раствором в соотношении 1:4. Буферный раствор по химическому составу соответствовал слюне и поддерживал значение рН «искусственного рубца», близкое к физиологическому (рН 6,0-6,5). Перед смешиванием буферный раствор подогревали до 39 °С и насыщали СО 2 .

Для исследования были приготовлены I контрольный рацион, включавший 70 % грубых кормов (сено луговое разнотравное) и 30 % концентрированных кормов (ячмень дробленый), и пять опытных образцов, в состав которых входили дополнительные компоненты в виде фитовеществ и химических элементов: II — CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ; ООО «НПК «Асконт+», Россия), III — Salviae folia (1,6 г/кг СВ), IV — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ), V — Salviae folia (1,6 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ), VI — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ). Выбор дозировок растительных препаратов и хлорида хрома был основан на ранее проведенных исследованиях и рекомендациях (21, 22). Каждый образец РЖ от 4 животных тестировали 4-кратно ( n = 16). Salviae folia (ЛСР-005376/07, АО «Красногорсклексредства», Россия) содержал 1,3-2,5 % эфирного масла, состоявшего из D-а-пинена, цинеола (около 15 %), а- и в—туйона, D-борнеола и D-камфоры. В листьях этого растения также обнаружены алкалоиды, флавоноиды, дубильные вещества, олеаноловая и урсоловая кислоты (21). Artemisiae absinthil herba (ЛСР-000171/08, ООО ПКФ «ФИТОФАРМ», Россия) содержал сесквитерпеновые лактоны, горькие гликозиды (абсинтин, анабсинтин, артабсин и др.), придающие растению своеобразный горький вкус, сапонины, флавоноиды, фитонциды, аскорбиновую кислоту, смолистые и дубильные вещества, калийные соли, артемизетин, эфирное масло (0,2-0,5 %), каротин, органические кислоты (яблочную, янтарную) (21).

Образцы корма массой 500 мг раскладывали в полиамидные мешочки, которые затем помещали в инкубатор в смесь буферного раствора с рубцовой жидкостью и инкубировали 48 ч при температуре 39,5 °С. По окончании инкубации образцы промывали и высушивали при температуре 60 °С до постоянной массы.

Коэффициент переваримости сухого вещества in vitro вычисляли как разницу массы образца корма с мешочком до и после инкубации по формуле К = (А - В)/С х 100 %, где К — коэффициент переваримости сухого вещества корма, %, А — масса образца корма с мешочком до инкубации, мг, В — масса образца корма с мешочком после инкубации, мг, С — исходная масса образца корма без массы мешочка до инкубации, мг.

После инкубации проводили отбор проб воздуха отдельно из каждой емкости инкубатора в специальные стеклянные шприцы объемом 200 мл3 с резиновыми пробками для определения содержания метана на приборе Кристаллюкс-2000М (ООО «НПФ «Мета-хром», Россия) методом газовой хроматографии. Количество летучих жирных кислот (ЛЖК) в РЖ определяли методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием на газовом хроматографе Кристаллюкс-4000М. Содержание различных форм азота оценивали на оборудовании фирмы «Millab» (Италия) по Кьельдалю.

Активность амилазы измеряли по Смиту-Рою в модификации по Аносону для определения высокой активности фермента в панкреатическом соке (23) и выражали в мг расщепленного крахмала • мл ^{- 1} • мин ^{- 1}. Методика определения активности амилазы основана на гидролизе крахмального клейстера. Измеряя интенсивность окрашивания раствора крахмала с йодным реактивом на КФК-3-01 (ОАО «ЗОМЗ», Россия), устанавливали скорость гидролиза клейстера (субстрат амилазы). Активность протеолитических ферментов оценивали по количеству расщепленного казеина, очищенного по Гаммерстену, при колориметрическом контроле (X = 450 нм) (24). Методика основывалась на колориметрическом определении концентрации казеина на КФК-3-01. Сухое вещество биосубстратов (СВ) определяли методом высушивания до постоянной массы при 60 °С.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования выполняли в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: Приказ Минздрава СССР ¹ 755 от 12.08 1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). При проведении экспериментов были предприняты меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшить число опытных образцов.

Полученные данные обрабатывали с помощью программы SPSS Statistics 20 («IBM», США). Рассчитывали средние значения ( М ), стандартные ошибки средних (±SEМ). Статистическую значимость различий между опытными и контрольной группами определяли с использованием t -критерия Стьюдента, различия считали значимыми при р < 0,05, р < 0,01.

Результаты. Структура и питательность рациона животных, от которых получали пробы рубцовой жидкости, представлены в таблице 1.

Переваримость СВ рациона при включении фитовеществ увеличивалась в третьем образце на 1,3 % (р < 0,05), а в четвертом уменьшалась на 2,9 % относительно контроля (рис. 1). Введение хлорида кобальта повышало переваримость СВ на 1,5 %. Наилучшая переваримость была отмечена при использовании композиции Artemisiae absinthil herba + CoCl2 — на 2,1 % выше, чем в контроле (р < 0,05). В присутствии Salviae folia + C0CI2 показатель был выше контроля на 1,3 %. Полученные результаты косвенно подтверждаются ранее проведенными исследованиями, где было установлено, что эфирное масло некоторых видов Artemisiae улучшало ферментацию в рубце in vitro и усвояемость сухого вещества (25). Этот факт объясняется вероятным повышением содержания терпенов, в значительном количестве присутствующих в экстракте полыни. Известно, что потребление корма обратно пропорционально концентрации терпенов в рационе, и жвачные не могут потреблять терпены выше порогового значения (26). Терпеноидные экстракты полыни подавляют микрофлору рубца и снижают скорость переваривания целлюлозы (27). Кроме того, J.P. Wu с соавт. (28) отмечали изменение ферментации в рубце и лучшее усвоение веществ при добавлении смеси эфирных масел орегано (Origanum vulgare L., Lamiaceae) и лактата кобальта. Аналогичный эффект наблюдался в нашем эксперименте в вариантах с S. folia (Lamiaceae) и A. absinthil herba.

1. Состав и питательность суточного рациона (расчет на 1 гол.) бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы, от которых получали рубцовую жидкость (ЦКП БСТ РАН, 2021 год)

Показатель                                Количество

Сено разнотравное, кг4,5

Сено бобовое, кг3,2

Концентраты, кг1,8

Соль поваренная, кг0,035

Витамин А, тыс. МЕ30,0

Витамин D, тыс. МЕ2,7

В рационе содержалось:

сухое вещество, кг8,78

обменная энергия, МДж70,0

сырой протеин, кг0,52

сырая клетчатка, кг2,46

нейтрально-детергентная клетчатка, кг0,55

кислотно-детергентная клетчатка, кг0,41

гемицеллюлоза, кг0,15

сырой жир, кг0,24

органическое вещество, кг8,20

кальций, г45,0

фосфор, г33,0

Рис. 1. Переваримость in vitro сухого вещества рационов с добавками фитопрепаратов и CoCl 2 после нахождения в течение 48 ч в рубцовой жидкости бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы: I — контрольный рацион, II — CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ) , III — Salviae folia (1,6 г/кг СВ), IV — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ), V — Salviae folia (1,6 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ), VI — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ) ( n = 16, M ±SEM, ЦКП БСТ РАН, 2021 год).

* и ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р ≤ 0,05 и p ≤ 0,01.

Использование Artemisiae absinthil herba повышало содержание общего азота на 11,6 % (р ≤ 0,05) относительно контроля. Во II образце количество общего азота снижалось на 10,6 %, в III — на 22 %, в V — на 19,7 %, в VI — на 14,4 % (р ≤ 0,05). В отношении белкового азота была обнаружена прямая взаимосвязь с обменом общего азота (табл. 2). Содержание небелкового азота в опытных вариантах, напротив, было выше, чем в контрольном:

в III — на 76,7 % (р ≤ 0,05), в IV — на 144,3 % (р ≤ 0,05), в V — на 28,3 %, в VI — на 16,7 %.

2. Содержание азота после инкубации in vitro образцов рационов с добавками фитопрепаратов и CoCl 2 в рубцовой жидкости бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы ( n = 16, M ±SEM, ЦКП ФНЦ БСТ РАН, 2021 год)

Вариант	Форма азота, мг%
	общий  небелковый аммиачный1мочевинный белковый

I (контроль)	92,4±1,71	21,0±1,13	4,2±0,90	4,1±1,51	71,4±2,02
II (CoCl 2 , 1,5 мг/кг СВ)	82,6±1,12	19,6±1,42	3,5±0,91	6,4±1,20*	63,0±1,33
III ( Salviae folia , 1,6 г/кг СВ)	72,1±1,83*	37,1±1,31*	5,9±0,51*	6,0±0,81	35,0±1,21*
IV ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг СВ)	103,1±1,61*	51,3±1,71*	7,2±1,81	5,4±1,92	51,8±1,43
V ( Salviae folia , 1,6 г/кг СВ + CoCl 2 , 1,5 мг/кг СВ)	74,2±1,41*	26,9±1,32	3,9±0,73	4,5±1,13	47,3±1,71*
VI ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг СВ + CoCl 2 , 1,5 мг/кг СВ)	79,1±1,22*	24,5±1,53	6,7±0,82*	4,5±1,31	54,6±1,51*

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Содержание различных биологически активных веществ в растениях (29, 30), которые поедают животные, способствует изменению ферментативных процессов рубце. Возможна зависимость и от дозировки вводимых компонентов. Так, высокое содержание полыни в рационе овец приводило к увеличению количества аммиака и азота в рубце (31). Кобальт необходим ферментативным системам микроорганизмов рубца, участвующих в метаболизме питательных веществ (32, 33).

Вероятный механизм действия фитовеществ заключается в их способности ингибировать активность бактерий, продуцирующих аммиак в рубце, с соответствующим изменением содержания азота в рубцовой жидкости (34). Кроме того, снижение концентрации азотистых веществ может быть связано с увеличением протеолитической активности микроорганизмов, что мы обсудим ниже.

Содержание аммиачного азота оказалось максимальным при использовании Artemisiae absinthil herba как отдельно, так и в сочетании с СоCl 2 — соответственно 7,2±1,81 и 6,7±0,82 мг% (см. табл. 2).

Введение в микрорацион фитовеществ привело к повышению активности пищеварительных ферментов, амилазы и протеаз в РЖ in vitro (рис. 2, 3). Так, активность амилазы была выше относительно контроля во II образце на 64,5 % (р ≤ 0,05), в III — на 303,7 % (р ≤ 0,05), в IV — на 164,6 % (р ≤ 0,05), в V — на 130,7 % (р ≤ 0,05), в VI — на 11,9 %. Максимальная амилолитическая активность зафиксирована при использовании S. folia. Наши результаты подтверждают ранее полученные данные, согласно которым отвары надземной части Salvia aegyptiaca и Salvia verbenaca проявляли более низкую активность в отношении фермента α-амилазы (35). Имеется и противоположное мнение (36) о том, что водный раствор Salvia eriophora ингибировал фермент α-амилазу на фоне присутствия фенольных веществ (фумаровая и кофейная кислота, эпикатехин) в составе экстракта.

В контроле активность протеаз составила 32,7±0,12 мг•мл^-1•мин^-1, наиболее высоким показатель был при совместном использовании S. folia и CoCl 2 — в 12,4 раза выше контроля (р ≤ 0,05). В VI образце протеолитическая активность оказалась выше в 7,3 раза, чем в контроле (р ≤ 0,05). Использование хлорида кобальта усиливало активность в 3,2 раза (р ≤ 0,05), а фитовеществ S. folia и A. absinthil herba — в 3,4 раза (р ≤ 0,05).

В доступной литературе данные по этому вопросу противоречивы. Так, сальвианоловая кислота, наиболее распространенный биологически активный компонент Salvia miltiorrhiza, способна ингибировать действие металлопротеиназы (37). В то же время высокая протеолитическая активность могла быть связана с доминирующим действием кобальта. Известно, что водные металлокомплексы с кобальтом усиливают протеолитическую активность (38). Что касается Artemisiae, то эти виды трав содержат в своем составе азотистые метаболиты (39), вероятно, способствующие активации протеаз микроорганизмов рубца.

Вариант

Рис. 2. Активность амилазы (А) и протеолитических ферментов (Б) после инкубации in vitro образцов рационов с добавками фитопрепаратов и CoCl 2 в рубцовой жидкости бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы: 1 — контрольный рацион, II — CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ) , III — Salviae folia (1,6 г/кг СВ), IV — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ), V — Salviae folia (1,6 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ), VI — Artemisiae absinthil herba (2,0 г/кг СВ) + CoCl 2 (1,5 мг/кг СВ) ( n = 16, M ±SEM, ЦКП БСТ РАН, 2021 год).

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Наши исследования показали, что фитовещества S. folia и A. absinthil herba могут смещать ферментацию в рубце в сторону пропионата и бутирата. При использовании A. absinthil herba мы отмечали усиление метаболизма азота в РЖ, при этом наблюдалось увеличение количества общего азота на 11,6 %, небелкового азота — на 144,3 %, аммиачного азота — на 71,4 %, мочевинного — на 31,7 % (р ≤ 0,05). Ранее было установлено, что использование фитовеществ сдвигает ферментацию в рубце в сторону пропионата и снижает концентрацию аммиака и выработку метана за счет воздействия биологически активных веществ, таких как терпеноиды (40, 41) и эфирные масла (42, 43) и танины (44), на микроорганизмы рубца. Увеличение количества азотистых веществ может быть связанно также с наличием аналогичных метаболитов в Artemisiae (39).

Содержание ЛЖК в контрольном и опытных вариантах с добавлением фитовеществ оказалось достаточно низким (табл. 3). Включение в микрорационы хлорида кобальта увеличивало концентрацию уксусной кислоты при тестировании II и V образцов в 3,6 раза (р ≤ 0,01), VI — в 6,6 раза (р ≤ 0,01) относительно контрольных значений. Концентрация пропионовой кислоты также увеличивалась во всех опытных вариантах с CoCl 2 : в присутствии S. folia в 26 раз (р ≤ 0,01), A. absinthil herba — в 36 раз (р ≤ 0,05). Результаты свидетельствуют о том, что дополнительное включение хлорида кобальта может повышать активность микробной метилмалонил-КоА-му-тазы, что способствует увеличению количества пропионовой кислоты в рубцовом содержимом (45).

3. Концентрация летучих жирных кислот после инкубации in vitro образцов рационов с добавками фитопрепаратов и CoCl 2 в рубцовой жидкости бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы ( n = 16, M ±SEM, ЦКП БСТ РАН, 2021 год)

Вариант	Летучие жирные кислоты, ммоль/л
	уксусная	пропионовая	масляная	валерьяновая	капроновая
I (контроль)	0,070±0,0002	0,010±0,0001	0,020±0,0001	0,030±0,0004	0,008±0,0006
II (CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	0,250±0,0050**	0,014±0,0003	0,008±0,0020	0,020±0,0011	0,006±0,0010
III ( Salviae folia , 1,6 г/кг)	0,070±0,0020	0,050±0,0040*	0,060±0,0030*	0,041±0,0050	0,014±0,0003
IV ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг)	0,080±0,0010	0,020±0,0010	0,170±0,0020*	0,063±0,0040	0,030±0,0010
V ( Salviae folia , 1,6 г/кг + CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	0,250±0,0030	0,260±0,0020**	0,160±0,0030*	0,190±0,0020**	0,140±0,0020**
VI ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг + CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	0,460±0,0060**	0,36±0,00400*	0,180±0,0050*	0,030±0,0001	0,050±0,0002**
* и ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р ≤ 0,05 и р ≤ 0,01.

Количество масляной кислоты было выше контроля во всех вариантах с фитовеществами: в III — в 3,0 раза, в IV — в 8,5 раза, в V — в 8,0 раза, в VI — в 9,0 раза (р ≤ 0,05). Пропионовая кислота — единственная глюко-неогенная ЛЖК, образующаяся в рубце, которая всасывается и метаболизируется в сукцинат в результате ряда реакций (46, 47). Однако хлорид кобальта в дозировке 1,5 мг/кг СВ не оказал влияния на производство пропионата, способствовал снижению количества бутирата и повышению мета-нообразования на 51,2 % (р ≤ 0,05). Витамин В 12 служит фактором роста для руминальных бактерий, таких как Prevotella ruminicola и Methanomicrobium mobile. Prevotella ruminicola , деятельность которых повышает содержание пропионовой кислоты в рубцовом содержимом, что способствует увеличению концентрации метана.

Комбинации фитовеществ и хлорида кобальта положительно влияли на процессы ферментации in vitro в РЖ. Наилучший эффект был выявлен при использовании A. absinthil herba и хлорида кобальта: зафиксировано повышение переваримости СВ, при этом выработка метана снизилась на 33,9 %, увеличилось количество пищеварительных ферментов, а также концентрация ЛЖК в рубцовой жидкости (см. табл. 3, 4).

При промышленном производстве говядины крайне важен контроль за выбросом парниковых газов. Так, полифенолы, содержащиеся в фито-биотиках, могут существенно влиять на микробиом пищеварительной системы жвачных животных, включая сокращение обилия метаногенных архей (48). Эфирные масла благодаря их естественному происхождению и безопасности все чаще используются для модификации микробиома, особенно с целью снижения выработки метана у жвачных животных (34).

Концентрация метана в наших опытах при использовании хлорида кобальта повышалась относительно контрольных значений на 51,2 %, при введении Salviae folia — на 16,5 % (р ≤ 0,05). Композиции фитовеществ и хлорида кобальта способствовали снижению образования метана в рубце жвачных на 46,3 и 33,9 % соответственно в V и в VI образцах (р ≤ 0,05) (см. табл. 4).

4. Выделение метана после инкубации in vitro образцов рационов с добавками фитопрепаратов и CoCl 2 в рубцовой жидкости бычков ( Bos taurus taurus ) казахской белоголовой породы ( n = 16, M ±SEM, ЦКП БСТ РАН, 2021 год)

Вариант	Концентрация метана
	СН 4 , г/м3	^  эквивалент СО 2 е /г
I (контроль)	12,1±2,2	302,5±1,1
II (CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	18,3±2,3*	457,5±3,1*
III ( Salviae folia , 1,6 г/кг)	14,1±1,9*	352,5±2,4
IV ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг)	9,4±2,4	235,0±1,9*
V ( Salviae folia , 1,6 г/кг + CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	6,5±1,2*	162,5±2,3
VI ( Artemisiae absinthil herba , 2,0 г/кг + CoCl 2 , 1,5 мг/кг)	8,0±1,4*	200,0±2,5
* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

В некоторых работах сообщалось, что фитовещества эффективно снижают концентрацию ацетата и аммиака в рубце и выработку метана у мелких жвачных и мясного скота (49-5 1). В наших опытах количество метана снижалось только в варианте с A. absinthil herba на 22,3 %, а в варианте с S. folia, напротив, повышалось на 16,5 % (р ≤ 0,05).

Вероятным механизмом снижения метаногенеза может быть ингибирование ферментов, ответственных за этот процесс. Известно, что метил-КоМ-редуктаза играет значительную роль в метаногенезе (51). Поиск молекул-мишеней для ингибирования этого фермента у жвачных животных — важная задача. Получены данные, что фитохимические вещества имеют лучшую аффинность к водородной связи и могут использоваться для снижения метаногенеза (52).

Возможно, снижение метаногенеза происходит и в результате изменения в популяциях метаногенных бактерий в рубцовой жидкости. Ранее обнаружено, что экстракт A. capillaris уменьшал выделение метана на 14 % (р < 0,05) после 48 ч инкубации при снижении численности сообществ метаногенов (инфузории и популяции метанобактерий) (53). Аналогичный эффект наблюдался под влиянием смеси эфирных масел и карбоната кобальта (16). Кроме того, некоторые источники и дозировки кобальта оказывали токсическое воздействие на численность метаногенных бактерий (17).

Количество СН 4 и эквивалент СО 2 были максимально снижены при использовании композиции Salviae folia и CoCl 2 (р ≤ 0,05) . Молярные доли ацетата, пропионата и бутирата в этом варианте значительно повышались относительно контроля, при этом интенсивность обмена азота в РЖ была высокой. Установлено что введение кобальта в микрорацион без фитовеществ не снижало метанообразования и ухудшало переваримость СВ рациона. Ранее уже отмечалось, что суммарное содержание и количество некоторых короткоцепочечных жирных кислот в отдельности, соотношение ацетат: пропионат, рН и общее газообразование в рубце жвачных значительно зависят от определенных растительных субстратов (полынь, ромашка, фу-митория и мальва) (54), что наблюдалось и в наших экспериментах.

Таким образом, изменения метаболических параметров в рубцовой жидкости бычков in vitro при использовании растительных препаратов и хлорида кобальта (по отдельности и в сочетании) в составе биосубстратов не были единообразными. Фитовещества значительно повышали в рубцовой жидкости активность амилазы, протеаз, концентрацию летучих жирных кислот и активировали обмен азота, но также увеличивали количество выделяемого метана. Сочетание Artemisiae absinthil herba и Salviae folia с CoCl2 снижало метанообразование и усиливало процессы метаболизации. При использовании комплекса Artemisiae absinthil herba в дозировке 2,0 г/кг СВ и CoCl2 в дозе 1,5 мг/кг СВ отмечено увеличение активности пищеварительных ферментов и содержания метаболитов в рубцовой жидкости in vitro, снижение образования метана на 33,9 %, при этом переваримость СВ повышалась на 2,1 % по сравнению с контролем. Комплекс Salviae folia (1,6 г/кг СВ) и CoCl2 (1,5 мг/кг СВ) максимально снижал образование метана (на 46,3 %). Растительные препараты способствовали увеличению в рубцовой жидкости активности амилазы в 2,6-4,0 раза и протеазы в 3,6 раза при сравнении с контрольным вариантом. Однако мы не выявили закономерностей в изменении метаболических параметров в рубцовой жидкости в зависимости от доз при сочетании растительных препаратов и хлорида кобальта, поэтому мы планируем продолжить изучение влияния фитовеществ (по отдельности или в сочетании с другими веществами) на микробиом рубца жвачных.