Метод буккальных цитограмм для задач выделения групп риска развития миомы матки у работниц медеплавильного производства

Сахаутдинова Рената Рашидовна – кандидат медицинских наук, заведующий ДЛО НПО лабораторно-диагностических технологий (e-mail: ; тел.: 8 (343) 253-14-58; ORCID: .

Бушуева Татьяна Викторовна – кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, заведующий НПО лабораторно-диагностических технологий (e-mail: ; тел.: 8 (343) 253-14-58; ORCID: .

Панов Владимир Григорьевич – кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: ; тел.: 8 (343) 362-35-14; ORCID: .

Адриановский Вадим Иннович – кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории эпидемиологии и профилактики рака отдела медицины труда (е-mail: ; тел.: 8 (343) 253-14-56; ORCID: .

Гурвич Владимир Борисович – доктор медицинских наук, научный руководитель (e-mail: ; тел.: 8 (343) 253-87-54; ORCID: .

Сохранение репродуктивного здоровья работающих женщин является одной из приоритетных задач. Воздействие промышленных токсикантов относят к экзогенным факторам риска развития заболеваний репродуктивной системы, особенно при нарушении гормонального баланса, ожирении, хронических воспалительных заболеваниях гениталий и низком паритете [1, 2]. Миома диагностируется в 60–70 % случаев всех патологий матки. У женщин трудоспособного возраста регистрируется наиболее высокий уровень заболеваемости и максимальная частота гистерэктомий [3]. По данным литературы, миома матки имеет тенденцию к «омоложению» [4]. Эпидемиология заболевания сильно недооценена, поскольку высокий процент случаев имеет бессимптомную стадию течения. Большое внимание при изучении рисков для репродуктивной системы уделяется механизмам репротоксичности меди и свинца [5]. Продолжает активно изучаться патогенетическая роль промышленных токсикантов, оказывающих мутагенный и канцерогенный эффекты, в развитии новообразований репродуктивной системы, так как хромосомные и генные мутации выявляются в 90 % случаев [6, 7]. Хромосомные нарушения коррелируют с фенотипом опухоли. В настоящее время при скрининговых обследованиях как в гигиенической практике, так и при проведении экспериментальных работ используют неинвазивные краткосрочные тесты, обладающие достаточной информативностью. Цитологическое состояние буккального эпителия является биологическим индикатором состояния организма, который изменяется при неблагоприятных воздействиях химической и биологической природы в условиях производства [8–14]. Известно, что функциональные патологические изменения буккального эпителия коррелируют с показателями нарушения гомеостаза организма, а также могут выступать в качестве маркеров предопухолевого состояния. С 2007 г. создан и действует проект HUMNxL по применению микроядерного теста на эксфолиативных клетках [15]. Метод буккальных цитограмм доступен для прижизненного гистологического исследования, может служить источником важной диагностической и прогностической информации о состоянии здоровья, стрессовых воздействиях, влиянии факторов производственной среды, а также в области онкологии, стоматологии и фармакологии [16, 17]. По данным литературы, метод исследования буккальных цитограмм широко используется для оценки микроядер у рабочих, профессионально подвергающихся воздействию потенциально канцерогенных агентов [18–21]. Согласно последним данным о ведущей роли генетического механизма развития миомы матки, обоснование диагностических критериев на основе цитогенетических изменений может быть полезным для ранней диагностики заболевания у женщин, контактирующих с промышленными токсикантами.

Цель исследования – разработать прогностическую модель оценки риска развития миомы матки у работниц медеплавильного производства, подвергающихся воздействию металлсодержащих аэрозолей, с применением метода буккальных цитограмм.

Материалы и методы. Обследовано 47 работниц медеплавильного предприятия. Сформировано две группы. Основная группа – 39 человек (возраст – 48,7 ± 1,7 г., стаж 14,8 ± 0,5 г.), работают в контакте с вредными факторами, ведущим из которых является промышленный аэрозоль сложного химического состава, состоящий из меди, свинца, никеля, железа, кремния диоксида, мышьяка и др. Представлены профессии: машинист крана, аппаратчик гидрометаллургии, аппаратчик в производстве редких металлов. По данным специальной оценки условий труда (СОУТ), машинист крана отделения анодов медеплавильного производства контактирует с аэрозолем, содержащим медь, фактический уровень фактора (1,58 мг/м³) в 3 раза превышает ПДК (0,5 мг/м³, класс условий труда (КУТ) 3.2), никель и его оксиды (0,058 мг/м³) в 1,16 раза выше ПДК (0,05 мг/м³, КУТ 3.1), кремния диоксид (уровень не превышает ПДК, КУТ 2.0). Аппаратчики гидрометаллурги купоросного цеха медного отделения подвергаются воздействию солей никеля в виде гидроаэрозоля (фактический уровень – 0,006 мг/м³, КУТ 3.2), меди и серной кислоты (фактический уровень не превышает ПДК, КУТ 2), аппаратчики участка переработки шламов в производстве редких металлов химикометаллургического отделения контактируют с никелем и его оксидами, свинцом и его неорганическими соединениями, кадмием и его неорганическими соединениями (фактический уровень не превышает ПДК, КУТ 2; уровень серной кислоты (1,8 мг/м³) в 1,8 раза превышает среднесменную ПДК (1,0 мг/м³), КУТ 3.1). Вышеперечисленные промышленные токсиканты обладают доказанным канцерогенным действием (кадмий, свинец, никель, серная кислота) и могут оказывать неблагоприятное влияние на репродуктивную систему (медь, свинец). Группа контроля – 8 человек, сотрудницы административного аппарата (возраст – 40,1 ± 0,92 г., стаж – 9,25 ± 0,64 г.), не подвергающиеся воздействию химических токсикантов.

Соскоб клеток буккального эпителия осуществляли с внутренней поверхности щеки. Материал с цитощетки равномерным слоем переносили на предметное стекло, высушивали естественным путем, окрашивали по Паппенгейму. Анализ препаратов осуществляли под микроскопом Primo Star (Carl Zeiss) при увеличениях 16×40 и 16×100. Подсчет проводили на 1000 клеток. Оценивались показатели: цитогенетические, пролиферации и деструкции ядра. Результат выражали в промилле (‰) [22]. Для оценки риска возникновения цитогенетических аномалий в клетках буккального эпителия в группах рассчитан индекс накопления цитогенетических нарушений (Iac – index of accumulation of cytogenetic damage) по формуле, представляющей собой произведение интегрального показателя цитогенетических нарушений (Ic – cytogenetic index) и интегрального показателя пролиферации (Ip – index of proliferation), деленное на апоптотический индекс (Iapop – apoptotic index):

Iac = ( Ic · Ip / Iapop ) · 100, (1)

где Ic – сумма клеток с микроядрами и протрузиями; Ip – сумма клеток с двумя и более ядрами; Iapop – сумма всех клеток в апоптозе (конденсация хроматина, кариопикноз, кариорексис, кариолизис, апоптотиче-ские тела). На основании индекса накопления цитогенетических нарушений группы риска классифицируют следующим образом: Iac ≤ 2 – низкий, 2 < Iac < 4 – умеренный, Iac ≥ 4 – высокий уровень риска [15].

При статистическом анализе использовали пакет Statistica 6.0. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Для выявления цитологических признаков, имеющих диагностическую ценность, использовали ROC-анализ.

Для решения вопроса влияния накопленных цитогенетических нарушений на риск развития миомы матки у женщин, работающих в условиях воздействия металлсодержащих аэрозолей, разработана прогностическая модель бинарной классификации, включающая логистическую регрессию с линейной зависимостью от заданных переменных (формула (2)) или с линейной зависимостью с добавлением перекрестных членов (формула (3)):

y = exp ( b 0 ⁺ b l x 1 ^{+ +} b n x n )

1 ⁺ exP ( ^Ь 0 ^{+ b} 1 x l ⁺ ■ ^{+ b}„ x „ ) ’

exP ( b 0 ^{+ b}1 x 1 ⁺ ■ ^{+ Ь}Л ^{+ b} 12 x l x 2 ^{+ b}13 x l x 3 ⁺ ■ b n - 1 . x . - 1 x . ) , (3)

• ^{1    +} exP ( b 0 ^{+ b} 1 x l ⁺ ■ ⁺ b . x . ^{+ b} 12 x l x 2 ^{+ b} 13 x l x 3 ⁺ ■ ^b. - 1 n x . - 1 x . )

где y – индикаторная переменная, показывающая вероятность наличия ( у = 1) или отсутствия ( у = 0) миомы матки; x₁ , x₂ ,…, x_n – независимые переменные – цитогенетические показатели; b 0 , b 1 … b n – теоретические коэффициенты.

При этом рассматривались модели от трех и четырех переменных, поскольку при одинаковом качестве моделей следует предпочесть модель с меньшим числом переменных. Критерием качества модели (2) или (3) выбран показатель отношения правдоподобий McFadden’a (или коэффициент псев-до-R2 McFadden’a). Ниже он будет обозначаться pR2. Для этого показателя модели со значениями pR2 = 0,2–0,4 считаются уже эффективными. Обязательным условием выбора эффективной модели являлось включение цитогенетических показателей – микроядра и протрузии, не исключая введения в расчеты цитотоксических аномалий.

Результаты и их обсуждение. В основной группе миома матки выявлялась достоверно чаще, чем в контрольной (25,6 % против 0, р ≤ 0,05). Учитывая тот факт, что миома – это полиэтиологиче-ское заболевание и роль генетического фактора на современном этапе точно не установлена, актуальным является выбор показателей цитограммы, которые, в первую очередь, свидетельствуют о генетическом риске. На первом этапе анализа полученных результатов проведено сравнение изменений цитогенетического статуса у всех работниц. Как видно из табл. 1, у женщин, контактирующих с вредными факторами, выявлено увеличение генотоксических показателей: микроядра (в 2,2 раза) и протрузии (в 1,8 раза) ( р < 0,05). Получено увеличение двуядерных клеток в 1,3 раза в препаратах буккальных цитограмм в основной группе ( р < 0,05). У всех обследованных женщин в основной группе получены изменения ранней и поздней деструкции ядра и цитоплазмы по сравнению с группой контроля. Выявлено увеличение показателей вакуолизации ядра и вакуолизации цитоплазмы в 1,6 раза, а кариолизис – в 1,8 раза. Показатель конденсации ядра в 1,3 раза выше в сравнении с группой контроля. Полученные данные свидетельствуют о цитотоксическом эффекте.

Индекс накопления цитогенетических нарушений в основной группе составил 3,3, что соответствует группе умеренного риска (2 <  Iac < 4), по сравнению с контролем – 1,7.

Для оценки генотоксического риска развития миомы матки была выбрана прогностическая модель на основе выявленных цитогенетических аномалий.

Таблица 1

Цитограмма буккального эпителия у женщин, работающих при воздействии вредных факторов производства, и группы контроля без воздействия (‰)

Показатель	Группа контроля, n = 8	Основная группа, n = 39
Микроядра	1,88 ± 0,23	4,00 ± 0,12 *
Протрузии	3,13 ± 0,44	5,72 ± 0,20 *
Двуядерные клетки	2,63 ± 0,26	3,67 ± 0,15 *
Перинуклеарная вакуоль	1,25 ± 0,16	1,56 ± 0,09
Конденсация ядра	3,88 ± 0,30	5,21 ± 0,20 *
Вакуолизация ядра	3,88 ± 0,40	6,59 ± 0,19 *
Вакуолизация цитоплазмы	4,50 ± 0,33	7,59 ± 0,20 *
Кариолизис	2,75 ± 0,25	4,97 ± 0,19 *

Примечание: * – отмечены величины, статистически значимо отличающиеся от контрольной группы ( p < 0,05).

Таблица 2

Показатели качества бинарного классификатора на основе логистической регрессии от трех переменных при выборе наилучшей модели на основе показателя pR ² без ограничения переменных (модель М₁) и с участием переменных «Микроядра» и «Протрузии» (модель М 2 )

Характеристика	Лучший набор
	M 1	M 2
	микроядра, перенуклеарная вакуоль, вакуолизация цитоплазмы	микроядра, протрузии, двухъядерные клетки
pR 2	0,570	0,383
AUROC	0,940	0,883
Чувствительность (TPR)	0,900	0,800
Специфичность (TNR)	0,828	0,759
Корреляция Мэтьюса	0,662	0,501
Диагностическое отношение шансов	43,200	12,571
Индекс Юдена	0,728	0,559

Рис. 1. ROC-кривые для моделей М1 и М2 из табл. 2

При сравнительном анализе двух моделей на основе логистической регрессии от трех переменных, сводные характеристики которых приведены в табл. 2, наилучшая модель без выбора ограничений переменных имеет значение коэффициента детерминации McFadden’a 0,570, а для наборов с участием переменных «микроядра» и «протрузии» pR ² = 0,383. При этом площадь под ROC-кривой соответственно равна 0,940 и 0,883 (рис. 1).

Несмотря на различия коэффициентов детерминации, характеристики моделей, включающие и не включающие генотоксические показатели, достаточно близки. Что можно рассматривать как целесообразность обязательного включения специфических показателей генотоксического действия в модель определения риска развития миомы матки у изучаемого контингента.

При включении в модель четырех переменных коэффициент детерминации обладает небольшой значимостью (для наилучшей модели pR2 = 0,105), а при включении двух показателей генотоксичности и двух показателей цитотоксичности коэффициент детерминации значительно улучшается (для наилучшей модели от четырех переменных, выбираемых из всех предикторов, pR2 = 0,938). Таким обра- зом, данная модель обладает наибольшей диагностической ценностью (рис. 2). Характеристика модели представлена в табл. 3.

Таблица 3

Показатели качества бинарного классификатора на основе логистической регрессии от четырех переменных при выборе наилучшей модели на основе показателя pR ² без ограничения переменных (модель М 1 ) и с участием переменных «Микроядра» и «Протрузии» (модель М 2 )

Характеристика	Лучший набор
	M1 = M2
	микроядра, протрузии, двухъядерные клетки, вакуолизация цитоплазмы
pR 2	0,938
AUROC	0,998
Чувствительность (TPR)	1,000
Специфичность (TNR)	0,966
Корреляция Мэтьюса	0,937
Диагностическое отношение шансов	+ ∞
Индекс Юдена	0,966

I Специфичность

Ml. AUROC =0.998

Рис. 2. ROC-кривая для модели М1 = М2 из табл. 3

Одним из факторов риска для репродуктивного здоровья женщин на медеплавильном производстве является аэрозоль сложного химического состава. Известно, что свинец, никель и кадмий, входящие в состав аэрозоля, имеют как мутагенные, так и репро-токсикантные свойства, вызывая индукцию хромосомных аберраций в соматических и половых клетках [23]. По данным литературы, воздействие высокими концентрациями меди вызывает увеличение частоты аберраций митоза в клетках. Повышенные экспозиции соединений никеля, обладающие еще и кластогенным действием, приводят к образованию микроядер. Механизм действия основан на разрыве ДНК и образовании ДНК-белковых связей. Также отмечаются увеличение частоты обмена сестринских хроматид и хромосомные аберрации. Кадмий и его соединения вызывают повышение частоты микроядер и хромосомных аберраций. К некоторым механизмам воздействия относят ингибирование ДНК-репарационных систем, влияние на клеточную пролиферацию и на функции супрессоров опухолей. При воздействии серной кислоты происходит связывание с молекулами ДНК, что приводит к нарушению деления цепей ДНК. Так как миома матки является полиэтиологич-ным заболеванием, одним из механизмов в развитии которой является молекулярно-генетический, актуальным остается изучение генотоксических свойств вышеперечисленных химических токсикантов на клетки миометрия и эндометрия. По данным зарубежных авторов, медь и свинец оказывают негативное влияние на функциональность эндометрия, ставя под угрозу процесс децидуализации и нарушая регенерацию эндометрия и адгезию эмбрионов, повышают риск развития рака эндометрия [24]. Также доказана взаимосвязь между объемами миоматозных узлов и концентрацией кадмия и его соединений в крови [25]. Никель и его соединения оказывают влияние на клетки эндометрия, повышая риск развития эндометриоза. В данном аспекте стоит акцентировать внимание на том, что микроядерный тест буккального эпителия выявляет микроядра в клетках, которые образуются непосредственно при повреждении ДНК при контакте с промышленными химическими токсикантами. Известно, что существует два типа микроядер по механизму образования: первый – в результате повреждения ДНК (представляет фрагмент хромосомы), второй – результат повреждения веретена деления в виде одной и более целой хромосомы, что может свидетельствовать как о генных, так и о геномных нарушениях. Полученные нами результаты, указывающие на увеличение числа цитогенетических нарушений, таких как микроядра и протрузии у работниц медеплавильного производства, не противоречат данным, описанным в ранее проведенных исследованиях, и еще раз подтверждают генотоксические свойства промышленных токсикантов, что может быть фактором риска развития миомы матки. Увеличение частоты двуядерных клеток у работниц также связано с токсическим воздействием химиче- ских соединений. Также известно, что образование двуядерных клеток происходит в результате деления ядра без деления цитоплазмы, при этом увеличивается их плоидность. Частота двуядерных клеток является индикатором пролиферативной активности [26]. Таким образом, заложенные в модель прогноза переменные, такие как микроядра и протрузии, могут играть ведущую роль в выявлении факторов риска развития миомы матки. Однако экспозиция химическими промышленными токсикантами способна формировать как приобретенные цитотоксические эффекты, так и приводить к реализации врожденных генотоксических эффектов. Полученные нами данные по увеличению клеток с ранней и поздней деструкцией позволяют дополнительно использовать эти переменные для оценки риска развития патологии эндометрия. В связи с тем что миома матки является мультифакторным заболеванием, роль эндокринной системы в механизмах ее развития одна из ведущих. Тяжелые металлы, входящие в состав промышленного аэрозоля, оказывают токсическое воздействие на гипоталамо-гипофизарную систему организма. Однако механизмы гено- и цитотоксического действия аэрозолей тяжелых металлов окончательно не изучены [27]. Таким образом, результаты исследования могут быть использованы для задач выделения групп риска развития миомы матки работниц, контактирующих с вредными химическими факторами на производстве. Представленная методология использования буккальных цитограмм для задач выделения групп риска развития миомы матки у работниц медеплавильного производства, а также полученные в настоящем исследовании результаты подтверждают выдвинутое нами в качестве гипотезы предположение, что гено- и цитотоксичность вредных производственных факторов в отношении клеток буккального эпителия представляет собой близкие по механизму эффекты развивающихся патологических процессов в тканях миометрия, что позволяет их экстраполировать. Включение данных цитогенетического и гормонального статуса в разработанную модель прогноза риска развития миомы матки является актуальным и значимым для задач формирования групп риска развития нарушений здоровья у работниц, подвергающихся воздействию аэрозолей, содержащих мутагенные и репротоксичные элементы.

Выводы:

• 1.    Генотоксические и цитотоксические показатели в цитограмме буккального эпителия встречаются достоверно чаще у женщин, подвергающихся воздействию промышленных аэрозолей, содержащих мутагенные и репротоксичные элементы, по сравнению с контролем.

• 2.    Риск развития миомы матки может быть рассчитан с применением математической модели, включающей генотоксические и цитотоксические показатели.

• 3.    Расчет параметров модели, включающей генотоксические показатели прогноза и, прежде всего,

• 4.    Целесообразно продолжить исследование в данном направлении с введением в модели показателей гормонального статуса.

• 5.    Данные модели актуальны для задач формирования групп риска развития нарушений здоровья

такие переменные, как микроядра и протрузии, играет решающую роль в идентификации факторов риска развития миомы матки.

у работниц, подвергающихся воздействию аэрозолей, содержащих мутагенные и репротоксичные элементы.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.