Метод диагностики рака легкого человека с помощью одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов

рака [4]. Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 13-15% для развитых стран [6] и 9% для развивающихся [3]. Однако, несмотря на разнообразие существующих методов диагностики, выявляемость больных с I-II стадиями рака легкого составляет около 27%, а больных с III-IV стадиями – 66% [2]. При этом 5-летняя выживаемость после лечения I стадии РЛ соответствует 70%, а IV стадии – только 5% [2]. Таким образом, снижение смертности от рака легкого человека невозможно без ранней диагностики этого заболевания.

За последние годы произошел значительный прогресс в области фармакологии. В медицинскую практику стали внедряться новые диагностические и лекарственные средства, полученные с помощью современных биотехнологий, перечень которых достаточно широк и включает белки (гормоны, цитокины, факторы свертывания крови, моноклональные антитела, ферменты, колониестимулирующие факторы, вакцины и препараты, созданные на базе клеток и тканей), полученные с помощью генноинженерных и гибридомных технологий. В то же время все чаще начали применяться диагностические и лекарственные препараты на основе аптамеров – искусственных антител, которые по своей природе являются олигонуклеотидами. Чувствительность диагностических систем на основе аптамеров очень высока и зависит от типа мишени. В частности, аптамеры к небольшим молекулам имеют чувствительность на микро-молярном уровне, а к белкам проявляют чувствительность на наномолярном и даже на субна-номолярном уровнях.

Цель работы: описание нового метода диагностики рака легкого человека на основе одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов (аптамеров).

Материалы и методы исследований. Для селекции искусственных антител к опухолевой ткани легкого человека использовали послеоперационный материал опухолевой ткани легкого человека, предоставленный Красноярским краевым клиническим онкодиспансером. Для селекции использовали послеоперационный материал трех гистологических типов рака легкого (плоскоклеточный ороговевающий, плоскоклеточный железистый и мелкоклеточный), взятый от пациентов в возрасте 50-70 лет. Гистологический тип рака легкого при отборе искусственных антител не учитывался. Работа с биологическим материалом осуществлялась с разрешения Локального этического комитета Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» и Красноярского краевого клинического онкологического диспансера. Получение аптамеров к опухолевой ткани легкого человека проводили методом чередования позитивной и негативной селекции одноцепочечных ДНК-аптамеров из ДНК-библиотек N80 методом систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) [5]. Полученный пул аптамеров клонировали. Отдельные клоны, обладающие наибольшей специфичностью к опухолевой ткани, секвенировали. В результате были получены искусственные антитела (аптамеры) к опухолевой ткани легкого человека с флуоресцентной меткой Alexa-488, которые использовали для определения продуктов распада опухолевой ткани легкого человека в плазме крови. Для этого плазму крови инкубировали в течение 30 мин с маскирующей ДНК (0,1 мг/мл) для закрытия неспецифических сайтов связывания, а затем в течение следующих 30 мин – с аптамерами, связанными с биотином, и магнитными частицами, связанными со стрептавидином. Полученные комплексы концентрировали с помощью магнита на стенке пробирки, а надосадочную жидкость удаляли, затем комплексы, содержащие онкомаркеры, аптамеры и магнитные частицы, дважды отмывали фосфатным буфером с Са²⁺ и Mg²⁺ (рН 7,4) и разводили в 15 мкл буфера. После этого к исследуемому образцу добавляли аптамеры, меченые флуоресцентной меткой, и трижды отмывали фосфатным буфером с Са²⁺ и Mg²⁺ (рН 7,4). Подготовленный образец исследовали с помощью люминесцентной микроскопии на наличие флуоресцентной метки, свидетельствующей о присутствии в сыворотке крови белков опухолевой ткани.

Результаты и обсуждение. Селекцию аптамеров к опухолевой ткани легкого человека осуществляли путем чередования позитивной и негативной технологии cell-SELEX, поскольку она позволяет выбрать наиболее специфичные для опухолевой ткани аптамеры и исключить олигонуклеотиды, способные связаться со здоровой тканью легкого. Оценку специфичности аптамеров к ткани рака легкого осуществляли с помощью люминесцентной микроскопии. После инкубации аптамеров с опухолевой тканью легкого человека появлялась флуоресценция, свидетельствовавшая о ее связывании с аптамерами, в то время как эти аптамеры не связывались со здоровой тканью, вследствие чего флуоресценции не наблюдалось (рис. 1).

Рис. 1. Микроскопия опухолевой и здоровой тканей легкого человека: слева – световая микроскопия, справа – люминесцентная микроскопия

Для разделения полученного пула аптамеров на отдельные виды осуществляли процесс клонирования, в результате которого получали клоны аптамеров, подходящие для секвенирования. В результате было получено 25 уникальных последовательностей олигонуклеотидов, обладающих высокой степенью аффинности к опухолевой ткани. На основе полученных нуклеотидных последовательностей аптамеры были искусственно синтезированы. Примеры вторичных структур двух аптамеров представлены на рис. 2.

Ctcctctgactgtaaccacgactcatgaggtgtctcactttcattacgatcgtttaacgcgcataggtagtccagaagcc Ctcctctgactgtaaccacgcttttgtctttagccgaattttactaagccgggctgatcagcataggtagtccagaagcc

Рис. 2. Примеры вторичной конформации 17 и 19 клонов аптамеров к опухолевой ткани легкого человека

Наиболее специфичные клоны аптамеров были использованы для выявления в плазме онкобольных продуктов распада опухолевой ткани. Белки, выделенные из сыворотки крови онкобольных с помощью аптамеров и магнитных частиц, флуоресцировали в зеленом диапазоне. Аналогично проведенные процедуры с кровью здоровых людей не выявляли флуоресцирующих белков в сыворотке (рис. 3).

Рис. 3. Микроскопия плазмы крови больных раком легкого: а – световая микроскопия, б – флуоресцентная микроскопия

Выводы: проведенные исследования подтвердили возможность использования аптамеров к раку легкого человека для выявления продуктов распада опухоли в плазме крови онкобольных, а, следовательно, и возможность их применения для диагностики рака легкого человека.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2090) и КГАУ «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности».