Метод идентификации вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке в обеспечении инфекционной безопасности гемотрансфузий



Останкова Ю. В., Семенов А. В.

Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Санкт-Петербург

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В ПРИ НИЗКОЙ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКЕ В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ГЕМОТРАНСФУЗИЙ

Введение. Оккультное течение вирусного гепатита В (окГВ) описывается как стадия хронического вирусного гепатита В (ХВГВ), при которой при неопределяемом уровне HBsAg в сыворотке крови ДНК ВГВ обнаруживается в ткани печени, но крайне низкий уровень вирусной нагрузки как правило не позволяет обнаружить ее в крови стандартными методами. То есть диагностика, ограниченная ис- следованием HBsAg, неэффективна, инфицированные лица не только пополнят группу пациентов с криптогенным гепатитом или получат осложнения при коинфекции, например, с вирусом иммунодефицита человека или вирусом гепатита С, но могут стать источником распространения ВГВ, будучи донорами крови. Для скрининга на окГВ возможно использование и трактовка выявления в периферической крови антител HBcor IgG, но высокий уровень ложноположительных результатов, в том числе среди больных,у которых после лечения не определялась ДНК ВГВ в ткани печени, но обнаруживали антитела, свидетельствует о гипердиагностике при скрининге по HBcor Ig G.Выявление ДНК ВГВ в ткани печени остается «золотым стандартом» и практически единственным достоверным методом лабораторной диагностики окГВ. Идентификация и количественная оценка кольцевой ковалентно-замкнутой ДНК ВГВ в ткани печени позволяет с высокой точностью идентифицировать ВГВ в оккультной фазе течения заболевания, а также предварительно оценить уровень репликации вируса в гепатоцитах.Однако необходимость инвазивного вмешательства позволяет предложить метод только в качестве дополнительной диагностики в случаях, когда пункционная биопсия печени осуществляется по клиническим показаниям,но не дает возможности использовать его для скрининга доноров крови.

Цель . Разработка метода, позволяющего выявлять ВГВ при низкой вирусной нагрузке в плазме крови.

Материалы и методы . Были использованы образцы биопсийного материала и плазмы крови от пациентов с верифицированным ХВГВ, условно здоровых людей, а также HBsAg-позитивных и HBsAg-негативных доноров крови.

Результаты. Согласно разработанному нами методу, на первом этапе проводилась амплификация ДНК методом асимметричной ПЦР с использованием протяженных олигонукле-отидных праймеров с разной температурой плавления, комплементарных области наибольшего сходства геномов различных изолятов вируса гепатита В. Для повышения чувствительности проводилась вторая полимеразная цепная реакция с использованием продукта амплификации первой реакции и внутренних праймеров,соответствующих одному из че- тырех, рекомендованных при диагностике ГВ регионов генома ВГВ.При этом в составе амплификационной смеси на каждом этапе было предложено неравномерное соотношение дезоксинуклеозидтрифосфатов и высокая концентрация MgCl2, на разных этапах в экспериментально подобранных количествах используются формамид, глицерин и DMSO.

Аналитическую чувствительность метода проверяли методом поэтапного разведения образцов с известной вирусной нагрузкой, относительно «референсных» коммерческих тест-систем с предварительной экстракцией анализируемой ДНК из различного объема биологического материала. Чувствительность предложенного метода при использовании 100 мкл плазмы при стандартном методе экстракции ДНК с помощью коммерческого набора реагентов «АмплиПрайм Рибо-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, Москва) составила 5 МЕ/мл. Для определения специфичности разработанного метода в соответствии с отработанными условиями проведения ПЦР были исследованы предварительно охарактеризованные серологически и молекулярно-генетически негативные по ВГВ образцы плазмы. Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности разработанного метода при исследовании биологического материала, а также о возможности использования его при идентификации ВГВ нехарактерных для России генотипов.Разра-ботанный метод позволил выявить высокую распространенность оккультного ГВ у HBsAg-негативных ВИЧ- и ВГС-инфицированных лиц, пациентов с гепатитом неясной этиологии, а также доноров крови.

Выводы .Разработанный нами метод выявления ДНК ВГВ в плазме крови на основе технологии ПЦР при низкой вирусной нагрузке позволяет своевременно выявлять вирус гепатита В, в том числе малораспространенные в РФ геноварианты ВГВ, у доноров крови, позволяя совершенствовать инфекционную безопасность гемотрансфузий.