Метод искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем ложной мучнистой росы для определения эффективности лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов-антагонистов

Введение. Большую опасность для многих сельскохозяйственных культур представляет ложная мучнистая роса 67

(ЛМР). Особенно остро в последние годы стоит проблема защиты подсолнечника от этой болезни. Так, с появлением новых агрессивных рас возбудителя, ранее устойчивые сорта и гибриды поражаются болезнью в сильной степени. А повсеместное использование против ЛМР препарата Апрон (действующее вещество Металаксил) привело к появлению устойчивости патогена к этому фунгициду [1].

Достойной альтернативой пестицидам становятся микробиопрепараты. Исследования в области разработки биологических мер борьбы с возбудителем ЛМР проводятся и в нашей стране, и за рубежом. Известны результаты испытаний существующих биопрепаратов против возбудителей ЛМР на подсолнечнике [2] и овощных культурах [3]. Ведётся поиск штаммов-продуцентов микробиопрепаратов для защиты подсолнечника от ЛМР [4; 5; 6; 7]. Однако готовых и эффективных препаратов, защищающих растения подсолнечника от возбудителя ложной мучнистой росы, нет.

В России микробиологические препараты, зарегистрированные для защиты сельскохозяйственных культур от возбудителей ЛМР, отсутствуют.

Для разработки биологических мер борьбы с возбудителем ЛМР на подсолнечнике необходимо проведение ступенчатого скрининга выделенных штаммов-антагонистов [8].

В связи с тем, что возбудитель ложной мучнистой росы подсолнечника Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni (син. Plasmopara helianthi Novot.) облигатный паразит, то скрининг должен начинаться со второго этапа: биологическую активность штаммов необходимо определять в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения патогеном.

Нами испытаны методы инокуляции проростков подсолнечника возбудителем ЛМР, применяемые в мире для массовой оценки селекционного материала [9; 10; 11; 12; 13; 14]:

• -    в растильни, заполненные песком высаживали инокулированные возбудителем ЛМР проростки;

• -    в растильни с фильтровальной бумагой раскладывали инокулированные возбудителем ЛМР проростки;

• -    в рулоны из фильтровальной бумаги помещали инокулированные ЛМР проростки;

• -    рулоны из фильтровальной бумаги с проростками помещали в сосуды с суспензией зооспор. При этом семена раскладывали на различную высоту от уровня суспензии ЛМР – верхний ярус, средний и нижний;

• -    в растильни, заполненные песком и выстланные фильтровальной бумагой раскладывали инокулированные возбудителем ЛМР проростки.

Во всех методах перед инокуляцией семена раскладывали в рулоны и проращивали 2–3 суток, затем снимали лузгу и семенную оболочку для выбраковки семян, пораженных другими патогенами. Установлено, что все испытанные методы, кроме предпоследнего варианта, вызывали заражение проростков подсолнечника возбудителем ЛМР. В варианте с рулонами из фильтровальной бумаги при размещении проростков на различную высоту от уровня суспензии ЛМР наблюдалось загнивание проростков, особенно в рулонах, где проростки были ближе к воде или суспензии зооспор. При закладке в рулоны из фильтровальной бумаги уже инокулированных проростков заражение происходило, но во время роста корни переплетались, при разворачивании рулонов налет с листьев стирался, что затрудняло учет. Установлено, что если перед инокуляцией семян снимали лузгу и семенную оболочку, одновременно с лузгой убирали и пропагулы штаммов антагонистов, которыми обрабатывали семена подсолнечника, что снижало защитный эффект опытных образцов микробиопрепаратов. Поэтому в дальнейшей работе использовали модификацию метода в растильнях, заполненных песком и выстланных фильтровальной бумагой, без снятия лузги и семенной оболочки с семян, что позволяло в течение длительного времени сохраняться на семянках лабораторным образцам микробиопрепаратов и проявлять защитный эффект. Кроме того, этот метод позволял получить равномерные всходы, отбраковать проростки подсолнечника, поражённые другими патогенами, и исключал быстрое пересыхание фильтровальной бумаги, что недопустимо при заражении возбудителем ЛМР [15].

Результаты испытаний коллекционных штаммов антагонистов из рабочей коллекции лаборатории биометода агротех-нологического отдела ВНИИМК против возбудителя ЛМР с использованием данного метода приведены в нескольких публикациях [16; 17; 18].

Материалы и методы. Для заражения использовали возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni (син . Plasmopara helianthi Novot . ) – смесь наиболее распространённых рас в период проведения испытаний (в наших исследованиях 330, 710 и 730) в соотношении 1 : 1 : 1; сорт подсолнечника, восприимчивый к возбудителю ложной мучнистой росы, – ВНИИМК 8883.

Лабораторные образцы микробиопрепаратов изготавливали в препаративных формах «жидкая культура» (ЖК) и «смачивающийся порошок» (СП) по методикам, разработанным в лаборатории биометода ВНИИМК [19, 20]. Титр микробиопрепаратов определяли микробиологическим способом [21].

Семена подсолнечника обрабатывали лабораторными образцами микробиопрепаратов в оптимальной норме расхода для каждой препаративной формы, вручную, в круглодонных колбах, с нормой расхода рабочей жидкости – 15 л/т. Контроль – необработанные микробиопрепаратами семена с инокуляцией патогеном.

Методика.

Этапы искусственного заражения подсолнечника возбудителем ложной мучнистой росы.

• 1.    Растильни заполняли песком на 2/3 (дозированным количеством), выстилали поверхность песка двумя слоями фильтровальной бумаги и проливали водой (обязательно равным количеством). На увлажнённую фильтровальную бумагу раскладывали обработанные семена подсолнечника в шахматном порядке, в зависимости от размера растилен по 25 или 50 штук, закрывали увлажнёнными полосками фильтровальной бумаги с прослойкой ваты и проращивали до фазы семядольного коленца (рисунок, этап 1).

• 2.    В фазе семядольного коленца проростки подсолнечника заливали суспензией зооспорангиев возбудителя ЛМР (рисунок, этап 2), полученной смывом спороношения возбудителя болезни дистиллированной водой, обеспечивающей целостность оболочки большинства зооспорангиев, с последующим массовым выходом зооспор, с нагрузкой 90 зооспорангиев на 1 мл суспензии, из расчёта 2,8 мл на проросток, не погружая корни проростков целиком, и устанавливали температуру 16–18 °С на сутки.

• 3.    Инокулированные проростки выращивали при 16-часовом освещении, температуре 22–24 °С в течение 6 суток (рисунок, этап 3). Песок и фильтровальную бумагу увлажняли, не допуская пересыхания и излишнего переувлажнения.

• 4.    На 7-е сутки создавали влажную камеру (рисунок, этап 4), снижали температуру до 16–18 °С на сутки и проводили учет поражения проростков возбудителем ЛМР.

  

Для расчёта оптимальной нагрузки учитывали количество зооспорангиев в полученной суспензии в 100 мл воды с помощью камеры Горяева в трёх повторностях. Известно, что при наличии в 225 клетках камеры Горяева 90 зооспорангиев концентрация суспензии равна 100000 в 1 мл. При любом другом количестве зооспорангиев концентрацию вычисляли по правилам пропорции:

фактическое количество зооспорангиев – в 100 мл воды,

90 зооспорангиев – в х мл воды.

Расчёт необходимого количества маточной суспензии зооспорангиев (мл) на 1 литр воды делали по формуле:

МС = 90 (норма) / ф х 100, где МС — маточная суспензия зооспорангиев (мл), в расчёте на 1 литр воды;

ф - количество зооспорангиев в суспензии фактическое (в среднем по трем повторностям).

Затем маточную суспензию разбавляли водой до 1 литра с температурой +19 °С и получали рабочую суспензию с нагрузкой 90 зооспорангиев на 1 мл.

Рисунок - Этапы искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем ложной мучнистой росы

Биологическую эффективность препаратов определяли по формуле [22]:

С = 100 (a - b) / a, где С - биологическая эффективность, %;

• a - количество больных растений в контроле;

b - количество больных растений в варианте.

Результаты испытаний по определению биологической эффективности лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов-продуцентов в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем ЛМР в значительной степени зависят от соблюдения следующих условий:

• -    качества инфекционного материала (смыв спороношения, обеспечивающий целостность оболочки большинства зооспорангиев, с последующим массовым выходом зооспор);

• -    оптимальной нагрузки (90 зооспоран-гиев/мл);

• -    срока заражения проростков (фаза семядольного коленца, время инсталляции - сутки);

• -    температурного режима (не выше 18 °С - в период заражения и влажной камеры и 25 °С - в течение срока выращивания);

• -    режима увлажнения (не допуская полного покрытия корней проростков суспензией во время заражения и переувлажнения и пересыхания во время выращивания);

• -    длительности и качества подсветки (16 часов день, 8 часов ночь, с интенсивностью освещения не менее 8000 люкс);

• —    препаративной формы и качества (титра) наработанного лабораторного образца микробиопрепарата;

• -    качества обработки семян.

Заключение. Для определения биологической эффективности лабораторных образцов на основе штаммов-продуцентов микробиопрепаратов в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения семян подсолнечника возбудителем ЛМР рекомендуем использовать модифицированный нами метод инокуляции в растильнях, заполненных песком и выстланных фильтровальной бумагой, без снятия лузги и семенной оболочки с обработанных семян. Это позволяет в течение длительного времени на семянках и корнях проростков подсолнечника сохраняться пропагулам микробиопрепаратов и проявлять защитный эффект. Кроме того, этот метод позволяет получить равномерные всходы, отбраковать проростки подсолнечника, поражённые другими патогенами, исключает быстрое пересыхание фильтровальной бумаги, что недопустимо при заражении возбудителем ЛМР, или переувлажнение, что может способствовать смыву пропагул микроорганизмов. При выполнении вышеперечисленных условий можно обеспечить качественную оценку эффективности лабораторных образцов микробиопрепаратов для дальнейшего испытания лучших вариантов в полевых условиях.