Методические и практические аспекты определения общей ртути в образцах цельной крови, мочи и волос методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой

века связана с агглютинацией эритроцитов, ингибированием ферментов и нарушением белкового обмена. Ртуть попадает в организм ингаляционным, пероральным, трансдермальным путями и обнаруживается во всех органах и тканях человека [2–4]. По содержанию ртути в крови можно судить о недавнем или текущем заражении всеми формами ртути, по содержанию в моче – оценить текущее, недавнее заражение элементарной и неорганической ртутью, анализ волос позволяет определить поступление элемента в различные периоды времени [1, 5].

Референтные уровни содержания ртути в различных биосредах по данным научных изданий приведены в табл. 1.

Таблица 1

Референтные уровни содержания ртути в крови, моче (мкг/л) и волосах (мкг/г)

Автор (метод анализа)	Кровь, мкг/л	Моча, мкг/л	Волосы, мкг/г
ВОЗ, 2010 [5]	5–10	5,6 (<10)	<10
Н.У. Тиц (AAС) [3]	0,6–59	<20	<15
Н.И. Калетина [4]	3–11	2	0,5–1,5
А.В. Скальный [2]	–	0,1–2,0	0,05–2,0
C. Schulz (ИСП-МС) [6]	0,8–1,0	0,4–0,7	–
ALS Scandinavia (ИСП-МС) [7]	0,46–7,5	0,14–4,2	0,05–0,93
J.P. Goulle (ИСП-МС) [8]	0,94–8,13	0,14–2,22	0,31–1,66

По мнению исследователей Л.М. Каримовой, Т.К. Ларионовой и Г.Р. Башаровой [9], максимальный уровень содержания ртути в крови, при котором не наблюдаются сдвиги в гематологических, биохимических и иммунологических показателях, составляет 1 мкг/л. В методических рекомендациях по ранней диагностике токсического действия ртути в дозах малой интенсивности у детей (МР 2000/140), утвержденных Минздравом РФ, приводится фоновое содержание ртути в утренней моче детей

0,56 ± 0,07 мкг/л (диапазон 0,3–0,9 мкг/л)1. Комиссией по БМЧ Федерального агентства по окружающей среде Германии предложены референтные значения БМЧ-1 и БМЧ-2, составляющие для ртути в крови 5 и 15 мкг/л, а в моче – 7 и 25 мкг/л [1]. БМЧ-1 представляет собой концентрацию в биологическом материале, ниже которой нет риска для здоровья. При достижении концентрации уровня БМЧ-2 существует повышенный риск неблагоприятного воздействия, требующего устранения токсического воздействия. Очевидно, что значительные отличия в приведенных значениях и данных табл. 1 связаны не только с особенностями обследуемых популяций, но и с использованием различных методов анализа.

Для определения ртути в биосредах необходимы высокочувствительные и высокоэффективные методы анализа. К таким методам, в первую очередь, относятся масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой и атомноабсорбционная спектрометрия с электротермическим вариантом атомизации (ААС-ЭТ)2 [10]. Атомно-абсорбционная спектрометрия при определении ртути обычно применяется в варианте абсорбции холодных паров ртути с использованием специальных ртутно-гидридных приставок (РГП) к атомно-абсорбционным спектрометрам или в ртутных анализаторах [11]. Метод атомной абсорбции холодных паров обладает высокой чувствительностью (пределы обнаружения не уступают ИСП-МС) и селективностью за счет отгонки паров элементной ртути от матрицы пробы. В то же время в работе Н.Б. Иваненко с соавт. [12] указано, что из-за невысокой производительности данные методы уступают место методу ИСП-МС. В РФ в 2003 г. утверждены и введены в действие МУК 4.1.1483-03 по определению содержания химических элементов, в том числе ртути, в биосубстратах методом ИСП-МС3. Диапазоны определения ртути в различных биосредах и БАД составляют: 0,1–10 мкг/л, погрешность оп- ределения 40 %, 10–100 мкг/л, погрешность определения 20 %, ПО 0,01 мкг/л.

Вместе с тем при количественном определении ртути методом ИСП-МС возникают некоторые трудности, обусловленные физико-химическими свойствами элемента. Ртуть представляет собой жидкий металл серебристого цвета, летучий, устойчивый к действию воздуха и воды. Высокая летучесть ртути определяет необходимость консервирования образца на стадии пробоотбора. Ртуть обладает очень высоким потенциалом ионизации 10,44 эВ, что при масс-спектрометрическом анализе существенно ограничивает эффективность ее ионизации в плазме и приводит к низкой чувствительности метода. Кроме того, существенное затруднение вызывает «эффект памяти». Данное мешающее влияние объясняется плохой смываемостью остаточных количеств ртути на подающих путях масс-спектрометра, распылительной камере и горелке, деталях интерфейса [12, 13].

Использование МУК 4.1.1483-033 в клинико-лабораторной практике для определения содержания ртути оказалось затруднительным, так как методика не устанавливает точных параметров подготовки образцов и условий анализа.

Таким образом, актуальность вышесказанного определила цель исследования – оптимизация условий рутинного анализа биосред при определении содержания общей ртути методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Материалы и методы. Количественное определение ртути в пробах крови, мочи и волос осуществляли на масс-спектрометре Agilent 7500cx с октопольной реакционной/столкно-вительной ячейкой (Agilent Technologies, USA) с транзисторным генератором 27,12 мГц. Для введения проб использовали двухканальную распылительную камеру Скотта, которая охлаждалась с помощью элемента Пельтье до 2 ° С. Скорость подачи образца в распылительную камеру составляла 0,4 мл/мин. Масс-спектрометр был оснащен плазменной горелкой Fassel с диаметром инжекторной трубки 2,5 мм. Использовался жидкий аргон высокой чистоты 99,998 % (ТУ-2114-005-00204760-99). Максимальная скорость потока аргона составляла 20 л/мин, давление в канале подводки газа 700 ± 20 кПа, Т плазмы=8000–10000 К. Автоматизация процесса проведения анализа обеспечивалась автосэмплером марки G3160B (Германия).

Для настройки чувствительности прибора использовали раствор 7Li, 59Co, 89Y, и 205Tl в 2 %-ной азотной кислоте с концентрацией 1 мкг/л для каждого элемента (Tuning Solution, USA). В качестве газа-реактанта применялся гелий газообразный высокой чистоты (99,995 %). Для приготовления растворов элементов внутреннего сравнения (IS) использовали комплексный стандартный раствор 209Bi, 73Ge, 115In, 6Li, 45Sc, 159Tb, 89Y с концентрацией 10 мг/л в 5 % водном растворе азотной кислоты (Internal Standard Mix, USA), а также стандартный раствор 103Rh с концентрацией 10 мг/л в 2 % водном растворе соляной кислоты (Rhodium Internal Standard, USA). Использовали кислоту азотную особо чистую с содержанием: As, Cd, Cu, Mn, Pb, Sr, V ≤ ≤ 0,01 мг/кг, Cr, Ni ≤ 0,02 мг/кг, Tl, Zn ≤ 0,05 мг/кг (Nitric acid 69 %, Sigma-Aldrich, США).

Для разбавления применяли деионизованную воду с удельным сопротивлением 18,22 Мом - см, очищенную в системе Milli-Q Integral (Millipore SAS, France). Лабораторную посуду из стекла, тефлона, полипропилена промывали в ультразвуковой мойке Elmasonic S 100H (Germany) при температуре 45-50 ° С: 3-4 раза в дистиллированной воде по 10 мин со сменой воды; затем 30 мин – в азотной кислоте, разбавленной дистиллированной водой 1:5; далее посуду промывали 2–3 % раствором соляной кислоты или раствором 1 %-ной азотной кислоты, содержащим 5 мкг/л хлорида золота.

Важным этапом химико-аналитических исследований является стадия отбора и хранения пробы, особенно при условии летучести исследуемых элементов. Так, для предотвращения потери ртути при хранении и транспортировке пробы необходимо замораживать или вносить раствор хлорида золота (III). При добавлении AuCl 3 в образцы необходимо использовать реакционно/столкновительные ячейки, поскольку ионы хлора ведут к интерференционным наложениям при определении ванадия, мышьяка и селена. Для эффективной ионизации ртути в плазменном потоке, для повышения чувствительности масс-спектрометра важно установить значение мощности частотного генератора 1500–1600 Вт и расстояние от горелки до отбирающего конуса порядка 7,0–7,5 мм. Перед проведением анализа осуществляли настройку прибора в режиме No Gas (без газа-реактанта), проверяли чувствительность, уровень фона, уровень вторичных оксидных и двухзарядных ионов, производили переключение на режим работы с реакционной ячейкой (Reaction mode).

Перед проведением анализа необходимо, чтобы гелий заполнил все подающие пути и реакционную ячейку со скоростью 10 мл/мин, далее прибор оставляли на 30 минут для стабилизации.

Для приготовления градуировочных растворов использовали стандартный раствор ионов ртути с концентрацией 10 мг/л в 5 % растворе азотной кислоты (Calibration Standard 2A – HG, USA).

Одним из способов минимизации «эффекта памяти» является определенный порядок измерения градуировочных растворов и непосредственно самих образцов: в плазму сначала подаются реальные пробы с низким содержанием ртути, а затем растворы для градуировки от самого низкого к более концентрированному. В настоящее время нами при исследовании ртути в образцах верхняя точка градуировочного графика не превышает 1,0 мкг/л, это также минимизирует загрязнение прибора, а следовательно, и «эффект памяти». Построение градуировочного графика проводили по точкам 0,0; 0,1; 0,5; 1,0 мкг/л (рисунок).

Для получения точных и достоверных результатов анализа необходимо, чтобы инструментальный фоновый уровень был минимальный. Из представленного на рисунке градуировочного графика видно, что концентрация, эквивалентная фону (BEC), не вносит вклад в результаты анализа. Коэффициент корреляции r равен 0,9995, а предел инстру- ментального обнаружения (DL) составляет 0,00478 мкг/л.

Одним из инструментальных приемов, позволяющих нивелировать матричное влияние насыщенной структуры матрицы крови, дрейф чувствительности прибора во время анализа, разность плотностей градуировочных и исследуемых растворов, низкую степень ионизации определяемых ионов, является установление оптимального элемента внутреннего сравнения ( IS ). Для этого использовали образцы крови с аттестованным значением содержания ртути и подвергали пробоподготовке с добавлением раствора комплексного внутреннего стандарта. Минимальные погрешности определения ртути в крови в различных диапазонах концентраций установлены при использовании в качестве внутреннего стандарта ¹⁵⁹Tb и ¹⁰³Rh. Немаловажным также является значение холостого опыта, в особенности при определении элемента на уровне нг/л. Так, при использовании¹⁵⁹Tb и ¹⁰³Rh холостая проба составляла порядка 8 мкг/л, при использовании ¹¹⁵In и ²⁰⁹Bi – порядка 18–19 мкг/л.

Кровь. Отбор проб крови производили из локтевой вены в вакуумные пробирки из полипропилена c напылением лития гепарина (PUTH, China). Возможно хранение проб в холодильнике (от 0 ° С до 4 ° С) в герметично закрытой пробирке до трех суток или длительное хранение при замораживании.

Рис. Градуировочный график для ионов ртути

Таблица 2

Метод «введено/найдено» для проб крови, мочи и волос

Образец	ПО (LOD) в растворе	В пробе без добавки	В пробе с добавкой	Введено/ найдено	∆ , %
Кровь (№ 1), мкг/л	0,0015	0,012	0,03	0,02/0,018	10
Кровь (№ 2), мкг/л	0,0015	0,042	0,065	0,02/0,023	15
Моча (№ 1), мкг/л	0,012	0,080	0,19	0,1/0,11	10
Моча (№ 2), мкг/л	0,012	0,045	1,18	1,0/1,14	14
Волосы (№ 1), мкг/г	0,003	0,087	0,19	0,1/0,103	3
Волосы (№ 2, мкг/г	0,003	0,147	0,253	0,1/0,105	5

Для разложения проб крови исследуемый образец объемом 0,1–0,2 мл вносили в конические центрифужные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой, добавляли 0,2–0,4 мл азотной кислоты (68 %) и 0,1 мл комплексного внутреннего стандарта, далее тщательно перемешивали. Пробирки оставляли на 2–3 часа, далее доводили объем до 10 мл, центрифугировали 10 минут со скоростью 2700–3000 об./мин на центрифуге ЦЛМН–Р10–01– «Элекон» (Россия) и переносили в виалы для последующего масс-спектрометрического анализа. Параллельно для каждой серии проб готовили холостой опыт, который подвергался всем стадиям пробоподго-товки и включал все используемые реактивы, что и анализируемые пробы.

Моча. Отбор проб утренней мочи производили в стерильные полипропиленовые контейнеры на 125 мл с винтовой крышкой (F.L. Medical S.r.l., Torreglia, Italy). Образцы мочи напрямую анализировались после разведения 1/10 1 % раствором азотной кислоты: к 0,5 мл мочи добавляли 4,45 мл 1 % водного раствора HNO 3 и 0,05 мл раствора внутреннего стандарта.

Волосы. Волосы состригали с затылочной части головы на всю длину в количестве, позволяющем получить аналитическую пробу 0,1–0,2 г. Образцы волос хранили в бумажных пакетах. Разложение проб волос осуществляли в открытых пробирках: навеску волос массой 0,1–0,2 г помещали в конические пробирки из полипропилена вместимостью 15 мл, дозатором добавляли 0,1 мл раствора IS, добавляли 1–2 мл концентрированной азотной кислоты плотностью 1,415 г/см³, выдерживали 3–6 часов до растворения, добавляли 1–2 мл концентрированной перекиси водорода. Пробирку с содержимым взбалтывали, выдерживали 3–4 часа, затем доводили до 10 мл деионизованной водой и центрифугировали 10 мин на центрифуге ЦЛМН–Р10–01–«Элекон» (Россия) со скоростью 2700–3000 об./мин.

Контроль правильности результатов анализа образцов крови, мочи и волос проводили методом «введено/найдено» (табл. 2). Добавка вводилась в анализируемый образец перед про-боподготовкой. В табл. 2 приведены пределы обнаружения (LOD), рассчитанные по 3σ-кри-терию. Погрешность определения не превышала 15 %.

Проанализированы стандартные образцы крови SERONORM (Sero AS, Norway) blood L1 (LOT 1103128), L2 (LOT 1103129), L3 (LOT 1112691), мочи SeronormTM (Sero AS, Norway) urine (LOT 0511545) и волос Reference Material in Human Hair (IAEA-086, Vienna, Austria). Перед проведением анализа сертифицированные контрольные материалы подвергались той же процедуре подготовки, что и рабочие пробы. Контрольные образцы анализировались после каждой пятой реальной пробы. Данные табл. 3 свидетельствуют о достоверном совпадении между найденными и аттестованными значениями.

Таблица 3

Аттестованные и найденные средние значения содержания ртути в стандартных образцах крови, мочи и волос

Уровень	Аттестованное значение	Найденное среднее значение	∆ , %
SeronormTM urine ( n =5), мкг/л	39,8	39,3	1,2
Seronorm blood L1 ( n =5), мкг/л	1,5	1,71	14,0
Seronormblood L2 ( n =5), мкг/л	16,0	17,3	8,1
Seronorm blood L3 ( n =4), мкг/л	37,1	39,6	6,7
Reference Material in Human Hair ( n =10), мкг/г	0,573	0,635	10,8

Предложенная методика была апробирована в рамках международной программы испытаний LAMP, организованной Агентством по охране окружающей среды США (CDC, Atlanta, USA). Результаты исследования образцов крови на содержание ртути представлены в табл. 4.

Результаты внешнего контроля качества свидетельствуют об удовлетворительных результатах, что подтверждает приемлемый Z -индекс, значение которого по модулю | Z |≤2.

Проведена метрологическая аттестация предлагаемой методики определения ртути в крови, моче, волосах, выполненная в соответствии с нормативными документами РМГ 61-2010, ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002, ГОСТ Р ИСО 57252-2002, ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002, ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002, ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 и ГОСТ Р ИСО 5725-6-20024.

Методика выполнения измерений ртути в крови, моче и волосах обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 5.

Таблица 4

Содержание ртути в образцах крови LAMP (CDC, Atlanta, USA)

Раунд/код пробы	Аттестованное значение, мкг/л	Найденное значение, мкг/л	Z -индекс
31/1402	3,13	3,43	0,6
31/1403	8,00	8,6	0,7
32/1404	4,13	4,6	0,2
32/1406	2,57	3,7	–0,4
33/1407	1,68	1,38	–0,6
33/1408	6,24	5,58	–0,3
33/1409	10,52	9,58	–0,2

Таблица 5

Метрологические характеристики методики определения ртути в растворе, мкг/л

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений в растворе	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σ r , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) σ R , %	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности р =0,95), ±δ, %
Кровь, мкг/л, от 0,005 до 1,0 вкл.	9,19	13,23	29,42
Моча, мкг/л, от 0,04 до 1,0 вкл.	10,36	10,42	24,25
Волосы, мкг/г, от 0,1 до 1,0 вкл.	9,52	9,74	22,43

Таблица 6

Содержание ртути в диагностируемых биосредах

Материал	Группа	Пермский край	Канада [16]	Россия [14]	Германия [6, 17]	БМЧ-1 [1, 6]
Кровь, мкг/л	Взрослые	–	0,12–4,7	0,89–2,39	0,02–16	5
	Дети	0,02–1,2	0,27–6,39	0,2–0,43	0,8–1,0
Моча, мкг/ л	Взрослые	0,65–8,2	0,2–3,5	0,27–0,94	–	7
	Дети	0,45–0,8	0,2–2,82	–	0,4–0,8
Волосы, мкг/г	Взрослые	0,29–0,49	–	0,21–0,54	–	1

Разработанная методика определения ртути в биосредах на базе метода ИСП-МС позволяет выполнять определение элемента в крови в диапазоне концентраций 0,5 – 100 мкг/л при погрешности измерений 29,4 %, в моче – 0,4 – 100 мкг/л при погрешности измерений 24,2 %, в волосах – 0,001 – 100 мкг/г при погрешности измерений 22,4 %. Установлены ПО (LOD) для крови 0,0015 мкг/л, для мочи 0,012 мкг/л, для волос 0,003 мкг/л.

Результаты и их обсуждение. Апробация предлагаемой методики проведена при обследовании пациентов стационара и поликлиники ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (табл. 6). В таблице представлены данные о содержании ртути в биосредах жителей Канады, России и Германии. В обследуемой нами группе детей содержание ртути в крови и моче ниже уровня БМЧ-1. В моче экспонированных взрослых содержание ртути превышает уровень БМЧ-1.Уровни ртути в моче у неэкспонируемых жителей России составляют 0,27–0,94 мкг/л [14], а в группе рабочих промышленного предприятия 0,2–25,3 мкг/л [15].

В группе детей содержание ртути в моче, найденное нами, находится на уровне такового у детей Германии [6].

Найденное нами содержание ртути в волосах взрослых соответствует всем приведенным литературным данным [1, 6].

Выводы:

• 1.    На основании проведенных исследований предложены оптимальные условия рутинного анализа биосред при определении содержания общей ртути методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, позволяющие выполнять определение элемента в крови в диапазоне концентраций 0,5 – 100 мкг/л при погрешности измерений 29,4 %, в моче – 0,4 – 100 мкг/ л при погрешности измерений 24,2 %, в волосах – 0,001 – 100 мкг/г при погрешности измерений 22,4 %.

• 2.    Получена высокая сходимость результатов определения ртути в крови при участии в международной программе испытаний LAMP (| Z |≤2).

• 3.    Предлагаемая методика определения ртути в крови, моче и волосах методом ИСП-МС апробирована при обследовании детей и экспонированных взрослых. Полученные результаты удовлетворительно корреспондируются с литературными данными.

• 4.    Уровни ртути в биосредах неэкспонированных жителей Пермского края не превышают рекомендованных ВОЗ уровней БМЧ-1.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.