Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части гвоздики разноцветной (Dianthus versicolor Fisch.)

Гвоздика разноцветная обладает вяжущим, мочегонным, кровоостанавливающим, обезболивающим, противовоспалительным и антитоксическим действием. Настой травы применяют при поносах и как маточное средство и средство при различных внутренних и геморроидальных кровотечениях. В прошлом в народной медицине отвар гвоздики полевой употребляли при укусах бешеных животных.

Клиническими исследованиями доказано, что гвоздика разноцветная является активным маточным средством, не обладающим побочным ядовитым или раздражающим действием. Гвоздика способна возбуждать и повышать тонус гладких мышц матки. Интересно, что маточным действием обладают и другие виды гвоздики и даже другие роды семейства гвоздичных.

Цель работы – разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части гвоздики разноцветной.

Растительным объектом служила надземная часть гвоздики разноцветной, собранной в 2011-2013 гг. в фазу цветения в разных районах Бурятии.

Природные условия районов естественного произрастания видов семейства Caryophyllaceae – лесостепная и степная зоны Южного Забайкалья, которые различаются по рельефу, почве и другим факторам.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья, помешают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл 70%-ного этилового спирта, присоединяют к обратному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Затем колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл. Экстракцию проводят дважды в тех же условиях с 50 мл 70%-ного этилового спирта: 1-я экстракция в течение 60 мин и 2-я - 30 мин. Объем объединенного извлечения доводят 70%-ным этиловым спиртом до метки (раствор А).

• 2    мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 5%-ного раствора алюминия хлорида в 95%-ном этиловом спирте, 1 каплю 5%-ной уксусной кислоты и доводят объем раствора 95%-ным этиловым спиртом до метки (раствор Б). Оставляют раствор на 30 мин. Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 390 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Раствор сравнения: 2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5%-ной уксусной кислоты, доводят объем раствора 95%-ным этиловым спиртом до метки.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

D m 1 100 100 100 D m 5000

" D0-m-2-100-(100-W)" D0-m-(100-W)’ где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 — оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья (г); m0 - масса ГСО рутина; W - потеря массы при высушивании сырья, %.

Приготовление раствора рутина стандартного образца.

Около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 С, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 95%-ном этиловом спирте и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А1) [1] .

• 2    мл раствора А¹ переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 2 мл 2%-ного раствора алюминия хлорида в 95%-ном этиловом спирте, 1 каплю 5%-ного раствора уксусной кислоты и доводят объем раствора 95%-ным этиловым спиртом до метки, перемешивают и оставляют на 30 мин (раствор Б).

Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 390 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Срок хранения раствора А - 3 месяца. Раствор Б должен быть свежеприготовленным.

Раствор сравнения: 2 мл исходного раствора А1 переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5%-ной кислоты уксусной и доводят объем раствора 95%-ным этиловым спиртом до метки.

Для приготовления 5%-ного раствора алюминия хлорида в 70%-ном этиловом спирте 5 г алюминия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 70%-ного этилового спирта и доводят объем раствора до метки тем же спиртом.

При разработке методики было исследовано влияние различных технологических факторов на выход флавоноидов (прежде всего это концентрация экстрагента, степень измельчения сырья, время экстракции, температурный режим, соотношение сырья и экстрагента), а также были изучены условия комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом.

Для определения оптимальных условий экстракции флавоноидные извлечения готовили нижеследующим способом, варьируя исследуемый параметр экстракции.

В колбу помещали 1 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц 1, 2, 3 мм, добавляли 50 мл экстрагента и выдерживали в течение 1 ч при температуре кипения на водяной бане.

Все значения получены из 3 параллельных определений.

Результаты опытов с использованием различных концентраций экстрагентов приведены в таблице 1. Данные таблицы показывают, что оптимальным экстрагентом является 70%-ный спирт этиловый.

Таблица 1

Выход суммы флавоноидов в зависимости от концентрации экстрагента

№ п/п	Экстрагент	Содержание суммы флавоноидов, в пересчете на рутин, %
1	Вода дистиллированная	0,48
2	30% этиловый спирт	0,51
3	40% этиловый спит	0,53
4	50% этиловый спирт	0,60
5	60% этиловый спирт	0,64
6	70% этиловый спирт	0,72
7	80% этиловый спирт	0,53
8	96% этиловый спирт	0,24

Существенное влияние на скорость процесса экстракции оказывает температурный режим экстрагирования. В связи с этим изучено влияние температуры на выход суммы флавоноидов при соотношении 1:50, экстрагент – 70%-ный этиловый спирт. Результаты анализа приведены в таблице 2.

Таблица 2

Выход суммы флавоноидов в зависимости от температуры экстракции

№ п/п	Температура экстракции,  ºС	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	20 – 30	0,44
2	50 – 60	0,48
3	60 – 70	0,50
4	80 – 90	0,64
5	на кипящей водяной бани	0,72

Как видно из таблицы 2, при однократном заливе сырья максимальный выход достигается на кипящей водяной бани.

Далее было изучено влияние степени измельчения сырья на выход суммы флавоноидов. Сырье измельчали и просеивали через сита с отверстиями диаметром 1, 2, 3 мм. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Выход суммы флавоноидов в пересчете на рутин в зависимости от степени измельчения сырья

№ п/п	Степень измельчения сырья, мм	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	1	0,72
2	2	0,49
3	3	0,34

Из данных таблицы 3 следует, что оптимальной степенью измельчения растительного сырья является 1 мм.

При выборе времени экстракции полученные данные приведены в таблице 4.

Результаты таблицы свидетельствуют о том, что наилучшим временем экстрагирования является 60 мин, дальнейшее увеличение времени нецелесообразно ввиду незначительного выхода флавоноидов.

Немаловажным параметром при разработке методики является зависимость соотношения сырья и экстрагента, поэтому нами проанализирован выход суммы флавоноидов при различных соотношениях, а именно, 1 : 30; 1 : 50; 1 : 100.

Таблица 4

Выход суммы флавоноидов в пересчете на рутин в зависимости от времени экстракции

№ п/п	Время экстракции, мин	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	15	0,29
2	30	0,30
3	45	0,52
4	60	0,72
5	75	0,70
6	90	0,70

Таблица 5

Выход суммы флавоноидов в зависимости от соотношения сырье-экстрагент

№ п/п	Соотношение сырье-экстрагент	Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
1	1 : 30	0,55
2	1 : 50	0,72
3	1 : 100	0,64

На основании полученных данных можно заключить, что оптимальным соотношением между сырьем и экстрагентом является соотношение 1 : 50.

Для определения оптимального времени комплексообразования суммы флавоноидов скабиозы с алюминия хлоридом определяли оптическую плотность полученного комплекса на фоне чистого извлечения через равные промежутки времени. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6

Зависимость величины оптической плотности от времени реакции комплексообразования суммы флавоноидов гвоздики разноцветной с алюминия хлоридом

Время, мин	10	20	30	40	50	60	75	90
Оптическая плотность, у.е.	0,36	0,38	0,40	0,44	0,44	0,44	0,44	0,44

Данные таблицы свидетельствуют о том, что через 40 мин величина оптической плотности исследуемого комплекса достигает максимального значения и остается постоянной в течение 90 мин.

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве гвоздики разноцветной

n	0	S	S x	P	t	х	.,%
9	0,64	0,0268421	0,0084943	95	2,26	0,02	2,99

Таким образом, результаты наших исследований показывают, что оптимальными параметрами получения извлечений из надземной части гвоздики разноцветной являются: экстрагент – 70%-ный этиловый спирт, степень измельчения сырья – 1,0 мм, температура экстракции на кипящей водяной бане, соотношение сырье экстрагент – 1 : 50, кратность экстракции – 2, продолжительность I экстракции – 60 мин, II экстракции – 30 мин.