Методы микроклонального размножения

Микроклональное размножение растений представляет собой процесс быстрого размножения растений из исходного материала для получения многих потомков с использованием современных методов культивирования растительных тканей. В целом, процедура микроклональное размножение разделяется на 4 классических этапа:

• -    Процесс начинается с отбора растительного материала для размножения, изолирования эксплантов и введения их в культуру in vitro . Растительные ткани отбираются в стерильном состоянии из неповрежденного растения, что является

чрезвычайно важным условием для производства здоровых растений.

• -    Собственно микроклональное размножение. На данном этапе важно получить наибольшее число хорошо растущих меристематических клонов.

• -    Взращивание микропобегов и последующее их укоренение.

• -    Адаптация полученных из меристем клонов к нестерильным условиям окружающей среды, выращивание до определенных размеров растений в условиях теплиц и подготовка их к высаживанию в открытый грунт, согласно назначению [3].

Несмотря на то, что представленные этапы являются универсальными для процесса микроклонального размножения растений, для каждого вида и сорта растений на каждом из этапов подбираются определенные условия, в частности агрегатное состояние и состав питательной среды для культивирования. К настоящему моменту используется несколько питательных сред для размножения растений in vitro , но наиболее часто исследователи выбирают питательную среду Мурасиге-Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962), которая изначально была разработана для тканей табака.

Установлено, что кроме правильно подобранной питательной седы успех введения растительного материала в культуру in vitro также определяется способом и качеством стерилизации выбранного материала. Чем более нежная растительная ткань берется для размножения, тем ниже должна быть концентрация используемого для стерилизации агента для сохранения жизнеспособности ткани. Но при этом обработка должна быть достаточно сильной и разносторонней, чтобы предотвратить возможное внутреннее заражение экслан-тов. В настоящее время мнения ученых о том, какое же средство и какие условия обработке являются оптимальными для стерилизации растительных тканей расходятся, и поэтому подбор таковых нужно осуществлять под конкретный вид растительного организма и ткань, отобранную для размножения in vitro [3].

Методы микроклонального размножения астений

Изучение процесса микроклонального размножения в мире и наше стране начались в 60-х года прошлого века и к настоящему моменту установлено несколько методов или типов размножения астений in vitro:

• -    Метод, основанный на подавлении апикального доминирования и индукции развития пазушных почек;

• -    Метод, основанный на индукции возникновения адвентивных почек тканями эксланта;

• -    Метод размножения растений in vitro путем микрочеренкования;

• •    Метод микроклонального размножения растений, ориентированный на получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза и эмбриоидогене-за [4].

Метод размножения растений пазушными почками

В настоящее время данный метод считается наиболее надежным методом мик-роклонального размножения растений, который характеризуется радом преимуществ по сравнению с другими методами. Потенциальные возможности данного метода размножения растений реализуются за счет внесения в питательную среду цитокининов, подавляющих развитие верхушечной почки стебля и стимулирующих тем самым образование пазушных почек [5]. Данный метод основан на том, что у большинства высших растений в пазухах листьев присутствуют дополнительные меристемы, которые способны сформироваться в побег, идентичный главному.

Для получения пазушных побегов в условиях in vitro, в культуру вводят срезанные кончики побегов или же придаточные побеги, которые также были выращены в культуральных условиях. При культивировании биоматериала в среде, содержащий цитокинины, часто главный побег формируется и растет недоразвитым, в то время как за ним развиваются побеги второго и третьего порядков, формируя таким образом пышный пучок побегов. Как только пучок побегов достаточно сформировался, его разделяют на более мелкие пучки с общей корневой системой или же на отдельные побеги, которые в дальнейшем, при культивировании на новой среде будут способны давать такие же пучки побегов [4].

Метод размножения растений адвен-тироваными побегами

Адвентированными побегами называют такие, которые образовались из адвенти-рованных почек, непосредственно возникшими их тканей и клеток эксплантов культивируемых растений, обычно их не формирующих. Адвентивные почки образуются из меристем, чаще всего вторично сформированных из тканей каллуса, но в целом такого типа почки могут возникнуть как из меристемы, так и немеристемных тканей листьев и стеблей [6].

Так, например, в исследовании Lee J.H. и Pijut P.M. использовали листовые эксплантаты Fraxinus nigra двух типов и культивировали на среде Мурасиге-Скуга с добавлением различных концентраций регуляторов роста растений для индукции каллуса и образования адвентивных почек. Исследователями было установлено значительное влияние регуляторов роста на эксплантаты растений. Частота образования каллусов варьировала от 77,8 до 94,4% и 88,9-100% от одиночных листочков и целых сложных листьев соответственно [7].

Размножение растений in vitro микрочеренкованием

Микрочеренкование представляет собой усовершенствованный вариант традиционной методики размножения астений черенкованием. В настоящее время таким появилась возможность размножать таким способом большое количество видов растений. И самым ярким примером применения такой технологии является микро-клональное размножение черенкованием картофеля и далее кратко будет приведена технология такого метода размножения растений. Первоначально необходимо прорастить клубни картофеля в течении 10-15 дней для получения побегов с недоразвитыми листьями, которые сохраняют ювенильные свойства и носят название этиолированных побегов. Далее полученные стебли разрезают на фрагменты, которые должны содержать одну почку, стерилизуют эти фрагменты и помещают на по- добранную питательную среду. Находящиеся в сосудах с питательной средой фрагменты побега образуют растения, которые далее размножают черенкованием, разделяя на сегменты с одной пазушной почкой и одним листом, далее переносимые в сосуды с новой питательной средой для дальнейшего роста. В результате процесса образуются небольшие растеньица, которые можно высаживать в открытый грунт, где они превратиться в нормальные растения [4].

Метод микроклонального размножения растений путем получения побегов из каллуса

В основе данного метода размножения растений in vitro лежит способность клеток растительного экспланта дедифферен-цироваться и образовывать каллус. При изменении концентрации фитогормонов каллусов в питательной среде можно осуществлять регенерацию побегов или эмбриоидов. Данный метод мог бы быть передовым среди всех методов микрокло-нального размножения растений, если бы не характеризовался двумя значимыми недостатками, а именно в процессе культивирования у каллусов значительно снижается способность к регенерации побегов и пересадок каллусной ткани, а также в ходе культивирования в клетках накапливаются генетические изменения по типу анеу- и полиплойдий.

Ученые отмечают широкий ряд факторов, оказывающих влияние на цитогенетическую изменчивость при таком типе микроразмножения, и одной из весомых причин является присутствие в питательной среде ауксинов, в частности 2,4-Д, способных индуцировать эндоредупликацию или эндомитоз диплоидных ядер клеток растений in vitro [4]. Развитие растений из такого типа клеток приводит к возникновению растений с измененной морфологией, например, формируется неправильное жилкование или нарушение листорасположения, низкорослость и др.

Кроме цитогенетической изменчивости исследователями отмечен и другой недостаток каллусного метода, а именно потеря морфогенетического потенциала у клеток и тканей, длительное время культивируе- мых in vitro. Несмотря на все весомые недостатки этого метода микроразмножения растений, формирование побегов из каллусов является эффективным, а иногда и единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей in vitro.

Таким образом, микроклональное размножение представляет собой достаточно быстрый метод размножения растений, обладающий большим потенциалом для получения высококачественных и здоровых растений. Достижения в этой области привели к разработке нескольких методов микроклонального размножения, которые активно применяются в сельском хозяйстве, а также в области сохранения редких и исчезающих видов.