Мезенхимальные стволовые клетки и остеогенез (обзор литературы)

Костные клетки имеют мезенхимальное (мезенхимное, мезодермальное) происхождение. Во взрослом организме они образуются из остеогенных стволовых клеток-предшественников, которые локализуются на границе между костью и хрящевой или костномозговой тканью. Дифференцируясь, они превращаются в остеобласты, а затем - в остеоциты. Рост длинных трубчатых костей осуществляется путем энхондрального окостенения. Причем увеличение диафизов в ширину происходит только со стороны периоста, а метафизов – только со стороны эндоста. Процесс костной резорбции имеет, соответственно, обратное направление [10].

Образование костной ткани представляет собой сложный многоступенчатый процесс, при котором клетки различных гистогенетических линий проходят последовательную трансформацию путем пролиферации, дифференцировки и специализации с образованием композитной структуры, называемой костью. При этом следует подчеркнуть, что если костная и хрящевая ткани формируются в эмбриогенезе из дорсального сомита мезодермы, то кроветворная ткань, из которой ведут свое происхождение остеокласты - через стадию спланхнической мезодермы. По своему гистогенезу остеоциты и остеобласты ближе к соединительно-тканным, мышечным и кожным элементам, а остеокласты - к клеткам крови и эндотелию. Наличие в остеокластобла- стомах эпителиальной и мышечной тканей, по-видимому, подтверждает эту точку зрения [15].

В культуре ткани in vitro родоначальные клетки образуют прообраз хрящевой или костной ткани, который может быть представлен в форме колоний или так называемых колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф) [7, 8, 9]. С помощью хромосомных и биохимических маркеров на радиационных химерах было показано, что КОЕф имеют клональную природу, отличную от гемопоэтических клеток костного мозга, остеобластов и остеоцитов [11, 53].

Общей закономерностью для пула родоначальных клеток любой ткани, в том числе и костной, является постепенное снижение способности к самообновлению и пролиферации, утрата полипотентности, увеличение доли прекурсоров, находящихся в S-периоде клеточного цикла, повышение чувствительности к действию ростовых факторов, гормонов, цитокинов и других регуляторных молекул. Теоретически этот процесс может идти равномерно или скачкообразно. Вследствие этого остеогенез может протекать в различных режимах с образованием костной ткани, качественно и количественно отличной по своим морфофункциональным свойствам. На наш взгляд, имплантация биоматериалов в кость может включать тот или иной путь развития остеогенных клеток. Однако работ, выполненных в этом чрезвычайно интересном направлении, мы, к сожалению, не обнаружили.

Следует отметить, что все категории родоначальных клеток представляют собой чрезвычайно гетерогенную популяцию, внутри которой морфофункциональные свойства варьируют в широком диапазоне. Кроме того, для каждой из стадий их развития имеется значительное количество переходных форм, которые не могут быть идентифицированы с помощью имеющихся технологий. Несмотря на то, что методы выявления стромальных и остеогенных прекурсоров были открыты еще в начале 70-х годов, явного прогресса в понимании их свойств, способов регуляции и роли в процессах ремоделирования костной ткани достигнуто не было [4, 5, 7, 11].

Следует отметить, что стволовые и коммитированные клетки-предшественники костной и хрящевой тканей находятся под контролем локальных (короткоранговых) и дистантных регуляторных механизмов. В последнюю группу входят факторы, оказывающие свое действие через нейроэндокринную, иммунную, опиатную и другие системы путем выработки или связывания дальноранговых мессенджеров (эстрогены, глюкокортикоиды, эндорфины, адреналин и т.п.). Локальные механизмы действуют через прямое изменение морфофункциональных свойств микроокружения костной ткани, межклеточные контакты, локальную выработку цитокинов, медиаторов, короткоживущих биоактивных веществ и т.п.

Межклеточные взаимодействия относятся к морфогенетическим процессам, они контролируют дифференцировку, специализацию, мор-фообразование клеток в тканях и органах. Они осуществляются с помощью позиционноинформационных и индукционных взаимодействий, которые еще мало изучены [15, 22]. Тем не менее, согласно концепции позиционной информации, в организме существует морфогенетическое поле. Оно контролируется с помощью экспрессии гомейозисных генов типа HOX1, HOX2, HOX3, HOX4, HOX7 и заставляет клетки помнить не только место своей локализации в соответствии с координационными осями, но и выполнять миссию, которую они должны осуществить в процессе своей жизни (например, восстановление кости при ее повреждении). Считается, что в сохранении позиционной информации большую роль играют мезенхимальные элементы, в частности макрофаги, остеобласты, остеоциты, остеокласты, эндотелий и фибробласты [6, 20, 21].

Индукционные взаимодействия регулируют процессы пролиферации и дифференцировки самообновляющихся клеточных популяций с помощью цитокинов, ростовых факторов, различных метаболитов и короткоранговых мессенджеров, вплоть до прямых клеточных взаимодействий. Особенностью выбора направления дифференцировки поли- и бипотентных остеогенных предшественников является то, что он, в первую очередь зависит от парциального давления кислорода. Если это давление достаточно высоко, прекурсоры развиваются в направлении остеогенеза. При низком давлении, напротив, образуется хрящевая ткань [12]. Следует учитывать, что адекватное поступление кислорода к клеткам возможно только при наличии развитой сети микроциркуляторного русла: максимальная величина удаления костных прекурсоров не должна превышать 100 мкм [7].

Мезенхимальные клетки со стволовым потенциалом способны к дифференцировке в различные типы тканей (гемопоэтическая, эпидермальная и интерстициальная), которые характеризуются высоким уровнем самоподдержания [39, 58]. Наиболее частым источником мезенхимальных стволовых клеток (МСК) у взрослых особей является костный мозг, хотя они могут быть выделены из кожи, жировой и нервной тканей. МСК способны дифференцироваться при систематическом введении донорам в самые разнообразные органы и ткани (печень, нервы, адипоциты, мышцы, кость и хрящ).

Так, трансплантация КОЕф под капсулу почки или подкожно приводит к образованию костной и хрящевой тканей, но если их ввести в желудочки мозга или белое вещество мозга - дифференцируются в глию, реже – в нейроны. Мезенхимальные стволовые клетки до культивирования являются SHD+ , CD 29+, CD34- , CD 14-, CD 45- [7, 25, 41, 47, 54]. Остаются не ясными пути репрограммирования МСК. Возможно, они подчиняются стохастической модели и образуются прекурсоры с возможностью дифференцировки во все направления. Однако специфическое микроокружение не дает им реализовывать свои потенции [24].

Хотя большинство исследователей показали высокую пластичность МСК, полученных из различных тканей взрослых людей, лучше они проявляют свои свойства в условиях травмы или повреждения, вызванного, например, облучением, химической травмой, генетическими заболеваниями или инфарктом. При этом доля МСК в костном мозге составляет около 0,01% и уменьшается с возрастом [25, 29, 30, 47].

Предполагается, что сниженное количество стволовых клеток в поврежденном участке компенсируется за счет высокой активности микроокружения, что приводит к восстановлению образовавшегося дефекта [43]. Однако, как этот процесс протекает в реальной ткани, остается только догадываться [29].

Одной из категорий МСК являются костномозговые стромальные клетки, описанные А.Я. Фриденштейном еще в 1974 году. В стандартной системе in vitro они образуют колонии, состоящие из стромальных, остеогенных, хондроген- ных и жировых клеток. Позднее было показано, что они способны также формировать «линейные» нейроны и кардиомиоциты [21, 44]. Как оказалось, стромальные клетки костного мозга представляют собой гетерогенную популяцию предшественников, которые в постанатальном мозге плотно контактируют с гемопоэтическими клетками и поддерживают их пролиферацию и дифференцировку [13, 53]. В культуре ткани они проявляют выраженные клональные свойства, в связи с чем получили название колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф). Колонии способы к многократным репассевам с сохранением исходной морфологии и фенотипа [7, 15, 42]. Считается, что КОЕф - главная популяция остеогенных прекурсоров, ответственных за кругооборот костных клеток в течение их жизни в норме и патологии [14, 16].

Существование МСК в какой-то мере можно считать подтверждением господствовавшего до 60-х годов учения о так называемом гемоцитобласте (гемобласте, ретикулярной клетке), дающем начало кроветворным и стромальным (включая эндотелиальные) элементам [1, 2].

Открытие в 1961 г Till и McChuloch [56] селезеночных колониеобразующих единиц (КОЕc) казалось бы навсегда перечеркнуло это направление. Действительно, в данной системе доминирующими элементами были колонии, состоящие из эритроидных, лейкоцитарных, тромбоцитарных клеток. Тем не менее, встречались и недифференцированные, бластные колонии, составлявшие около 1-2% от общего числа КОЕс. Они выявлялись на 12-14 сутки культивирования, их роль и функция оставались малопонятными. Можно думать, данная технология неприемлема для количественного выявления МСК, т.к. они быстро расселяются по другим тканям, и только небольшое количество оседает в селезенке. Кроме того, авторы и их последователи долгое время ограничились описанием КОЕ, дающих начало кроветворной и лимфоидной тканям. Лишь через 40 лет, при трансплантации клеток костного мозга смертельно облученным животным с использованием хромосомных маркеров, было показано, что из клеток донора могут образовываться также мышечная, нервная и другие типы тканей.

Первые сомнения появились, когда Dexter в 1982 г. [23] создал систему длительного культивирования костного мозга in vitro. Оказалось, что в культуре шло активное кровообразование, формирование стромальных, жировых, эндотелиальных и мышечных клеток. Позднее были вскрыты принципиальные факты того, что кроветворение может идти в отсутствие костных клеток. Наряду с кроветворными стволовыми клетками были выявлены и другие родоначальные элементы, включая МСК.

Количество МСК, представляющих собой фибробластоподобные клетки, составляет около 1 на 105 адгезирующих стромальных клеток [20, 49, 51]. Этого количество недостаточно для клинического использования, в связи с чем обычно используют дополнительное культивирование, очистку от примесей других, нежелательных клеток. В идеале требуемое количество МСК необходимо получать во время одной процедуры без субкультивирования и сортировки клеток. Поэтому взятие костного мозга, ограниченного по объему, количеству клеточного материала и причиняющее пациенту боль и дискомфорт, не всегда приемлемо [63].

МСК можно выделить из различных тканей -гранулярной, мышечной, эмбриональной, соединительной [37, 45]. Однако наиболее перспективным можно считать получение МСК из жировой ткани, например, во время липоаспира-ции, у людей различной конституции и в любом количестве [63]. Из 1 см3 можно получить около 2-6х108 клеток. От одного донора можно выделить более 300 см3, т.е. около 150х109 кариоци-тов. Этого достаточно, чтобы получить необходимое количество МСК для терапевтических процедур без предварительного культивирования. В то же время при культивировании можно увеличить концентрацию МСК нужного фенотипа в сотни раз. Так, для наработки остеогенных клеток-предшественников в стандартную культуру добавляют бета-глицерофосфат (донор неорганического фосфата), аскорбиновую кислоту и дексаметазон. Для роста хондроцитов используют инсулин, бета-трансформирующий фактор роста и аскорбиновую кислоту [63]. При воcпроизведении методики необходимо помнить, что культивирование МСК – чрезвычайно капризный процесс и во многом зависит от качества реактивов, выбора сред и сывороток [31, 32].

Основным фактором роста костной ткани являются морфогенетические белки костной ткани (МБК). МБК – это димерные гликопротеины с массой 30 кД, которые входят в семейство β- трансформирующих факторов роста (ТФР), ответственных за процессы хемотаксиса, деления и дифференцировки костных клеток [38]. В настоящее время известно более 14 типов таких белков, 6 из которых имеют очень схожую структуру. Из них при ремоделировании кости большую роль играют МБК-2,4,7 [22, 39].

В раннем эмбриогенезе для образования хрящевой модели кости из мезенхимных клеток необходим МБК-4, затем подключаются МБК-2 и МБК-6 [38]. Причем последний фактор определяется в кальцифицированной зоне, а МБК-2 – в периостальной. Для образования небольших костей (ребра, стопа, кисть) важная роль принадлежит МБК -5. Он принимает участие в регуляции механизма конденсации мезенхимальных стволовых клеток в местах их роста.

Среди МБК-2 выделяют две формы – МБК-2 а и МБК-2 Р ( ранее идентифицированный как МБК-4), гены которых расположены в 20 и 14 хромосомах человека соответственно. МБК-3 (остеогенин) и МБК-3 Р (ростовой дифференци-ровочный фактор 10-го типа) контролируются генами 4-й и 10-й хромосом. МБК-7,8,8 р или остеогенные протеины 1, 2 или 3-го типов соответственно локализуются в 20-й хромосоме. МБК-14, 13, 12 имеют синонимы “хрящевые высвобождающиеся морфогенетические протеины 1,2 и 3-го типов” [50].

Следует отметить, что морфогенетические протеины оказывают влияние и на формирование нервных волокон, сосудов, зубов, сердца, лимфатической, кроветворной тканей, часто в кооперации с другими регуляторными макромолекулами типа ТФР —р [38].Это свойство придает МБК черты мультифакторного цитокина. При его введении происходит локальное образование костной ткани [50, 52], в том числе процесс эктопического костеобразования [57, 58, 61]. Данный процесс получил название остеоиндукции [19, 59, 60]. МБК является единственным из всех известных фактором, обладающим истинными остеоиндуктивными свойствами. Другие цитокины, как правило, являются синергистами МБК [38].

Исключением из этого правила служит, по-видимому, ТФР. Так, в присутствии рекомбинантного ТФР-1 вокруг кальцийфосфатной (КФ) керамики повышается объем новообразованной кости, возрастает площадь остеоидной поверхности на 5-6% и активность остеокластической резорбции. При этом процессы остеогенеза преобладают над остеолизисисом, т.е. активность остеобластов выше, чем остеокластов. В результате происходит замещение КФ новой костью, т.е. биомеханическое усиление процесса связывания имплантата с костной тканью [34,48]. Однако следует отметить, что этот эффект во многом зависит от дозы применяемого ТФР и обычно не превышает 4-5 недель, очевидно, за счет элиминации данного фактора из организма. Обладает ли ТФР прямыми остеоиндуктивными или остео-кондуктивными свойствами остается не совсем понятно, т.к. используемые модели in vivo и in vitro не позволяют однозначно ответить на этот вопрос [35].

Терапевтический потенциал МСК для терапии разнообразных заболеваний и тканевого инжиниринга чрезвычайно важен и перспективен. Концептуально существуют два главных типа применяемых стволовых клеток. Один основан на использовании клеток эмбрионального происхождения (ЭСК), другой связан с аутоло- гичными специализированными и (или) мезенхимальными стволовыми клетками (МСК). Хотя теоретически применение ЭСК более привлекательно, т.к. можно получить огромное число клонов данной категории предшественников, существует ряд методических и этических ограничений по их использовании в медицине. В противоположность этому аутологичные МСК не вызывают иммунологических конфликтов и их применение не имеет правовых и нравственных ограничений. Кроме того, при использовании ЭСК всегда существует потенциальная возможность их перерождения в опухолевые клетки [46, 55].

Самостоятельное использование МСК в травматологии и ортопедии для восполнения их дефицита или стимуляции костеообразования до настоящего времени не нашло широкого применения, т.к. оказалось малоэффективно. В последнее время активно развивается так называемый биомиметический принцип [27, 28]. Согласно ему для восстановления костного дефекта используется гибридный имплантат, состоящий из носителя (гидроксилапатит, трикальцифос-фат, коллаген, полимеры и т.п.), МСК и ростового фактора, преимущественно МБК и (или) ТФР [26, 36, 40]. Иногда дополнительно включают адгезирующие факторы [15]. Опыты по эктопическому костеобразованию показывают, что данная система может работать в прямом и опосредованном режиме. В первом случае в ней присутствуют экзогенные МСК, а во втором стволовые клетки мигрируют из окружающих тканей и аккумулируются на носителе [61].

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что в организме взрослого человека существует пул мезенхимальных стволовых клеток, которые способны дифференцироваться практически по всем известным направлениям, в частности, в остеогенные и хондрогенные клетки. Изучение их свойств, пролиферативного и дифференцировочного потенциала, отработка технологии трансформации в клетки нужного типа позволит разработать новые методы клеточной терапии многих заболеваний, в том числе связанных с патологией опорнодвигательного аппарата. Вместе с тем процесс коммитирования МСК в направлении остеогенеза – сложный, многоступенчатый процесс, многие детали которого остаются нераскрытыми. Требуется проведение более углубленных фундаментальных исследований в этом направлении с последующим практическим использованием выявленных закономерностей при лечении той или иной формы патологии.