Микрофлора кишечника крыс при экспериментальном антибиотикоассоциированном дисбиозе и возможность ее коррекции препаратом на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов

По данным экспертов Всемирной организации охраны здоровья животных, Всемирной Организации Здравоохранения и Продовольственной и сельскохозяйственной организация ООН желудочно-кишечные болезни сельскохозяйственных животных занимают одно из ведущих мест в структуре общей заболеваемости болезней пищеварительной системы [3, 7]. Повышается также и количество инфекционных заболеваний, связанных с влиянием различных провоцирующих факторов, таких как применение антибиотиков [4, 5, 6]. В последние годы среди большого числа изучаемых биологических объектов для сельского хозяйства важное значение приобретают молочнокислые и пропионовокислые бактерии, то есть группа микроорганизмов, оказывающих, при назначении в достаточных количествах, благоприятное влияние на здоровье [2].

Цель данной работы – оценка эффективности препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов при коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры крыс.

Материал и методы исследований. Исследования проводили на базе лаборатории прикладной энзимологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности». Объектом исследования являлся биопрепарат на основе изолятов молочнокислых (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bucheri, Lactobacillus salivarus, Lactococcus lactis) и пропионовокислых микроорганизмов (Propionibacterium freudenreichii) [1].

Опыты были проведены на 18 белых крысах в возрасте 3 месяцев с исходной массой тела 180-200 г., полученных из вивария лабораторных животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В опыт брали клинически здоровых животных, содержащихся на стандартном рационе и прошедших до начала эксперимента 14-дневный карантин.

Экспериментальные животные были разделены на три равные группы: 1. Контрольная группа - интактные животные (n = 6); 2. Группа «дисбиоз» – животные с экспериментальным дисбиозом (n=6). Крысам ежедневно однократно в течение 5 суток перорально через металлический зонд вводили раствор линкомицина в дозе 60 мг/кг живой массы; 3. Группа «дисбиоз+лечебный препарат» – группа с экспериментальным дисбиозом и корригирующим введением тестируемого препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов (n=6). Крысам ежедневно однократно в течение 7 суток интрагастрально вводили раствор линкомицина, а с 8-го по 21-й день – тестируемую суспензию клеток штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий.

Количественный и качественный состав микрофлоры кишечника определяли методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ). ДНК, анализируемых микроорганизмов, выделяли из фекалии с помощью набора реагентов «Колонофлор-8» (Альфалаб, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Постановку ПЦР-РВ и интерпретацию полученных данных осуществляли на приборе MiniOpticon (BioRad, США) по следующей программе: 94 °С – 15 минуты, затем 5 циклов: 94 °С – 5 секунд (денатурация), 58 °С – 11 секунд (отжиг праймеров), 72 °С – 10 секунд (элонгация), 40 циклов: 94 °С – 5 секунд, 58 °С – 30 секунд, 72 °С – 10 секунд. Количество выявленных микроорганизмов выражали в десятичных логарифмах ген-эквивалентов на 1 г фекального образца (lg ГЭ/г).

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли нахождением средних арифметических значений и их стандартных ошибок, используя пакет программ Microsoft Office Excel 2013. Достоверность различий оценивали с помощью t-теста Стьюдента, различия считали статистически достоверными при p<0,05.

Результат исследований. В ходе изучения действия препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов на состав микробиоценоза кишечника при экспериментальном дисбиозе у крыс были проанализированы более 50 образцов фекалий.

На рисунке 1 представлены кривые накопления сигнала по каналам FAM и HEX , по которым в дальнейшем производился анализ результатов для определения содержания ДНК микроорганизмов в образцах.

Рисунок 1 – Кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналам FAM и HEX исследованных образцов

Рисунок 2 – Влияние биопрепарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов на состав микробиоценоза кишечника при экспериментальном дисбиозе у

крыс

Исследование количественного и качественного состава мукозной микрофлоры кишечника интактных крыс выявило значительное преобладание Lactobacillus spp . ((8,17±0,3) lg КОЕ/г), бактерий вида Faecalibacterium prausnitzii ((7,38±0,15) lg КОЕ/г) и группы Bacteroides fragilis ((8,17±0,3) lg КОЕ/г) (Рисунок 2).

Введение антибиотика линкомицина привело к снижению численности доминантных представителей микрофлоры кишечника здоровых животных. Содержание бифидо- и лактобактерий снизилось в 10,7 и 11,8 раз, соответственно. Число бактерий вида

F.prausnitzii увеличилось в 82 раза, E.coli – в 41 раз, микроорганизмов группы B.fragilis – в 79 раз по отношению к значениям определяемого показателя контрольной группы. В составе микрофлоры кишечника данной экспериментальной группы животных наблюдалось появление бактерий C.difficile и S.aureus ((6,46±0,11) и (7,06±0,26) lg КОЕ/г, соответственно), а также дрожжеподобных грибов рода Candida ((6,2±0,17) lg КОЕ/г).

Применение исследуемого препарата на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов на фоне экспериментального дисбиоза оказало положительное воздействие на качественное и количественное содержание микроорганизмов микрофлоры кишечника крыс. Количество бифидо- и лактобактерий увеличилось по сравнению с группой животных с дисбиозом и достигло достоверных значений группы интактных животных, а содержание бактерий видов Staphylococcus aureus, Faecalibacterium prausnitzii и Escherichia coli, микроорганизмов группы Bacteroides fragilis снизилось. Условно-патогенная бактерия вида Staphylococcus aureus, наблюдавшаяся в группе дисбиоз, определялась в количестве (5,02±0,16) lg КОЕ/г, что является допустимым значением нормы.

Заключение. Таким образом, 7дневный прием противомикробного препарата линкомицина приводит к развитию значительного нарушения в качественном и количественном составе микрофлоры кишечника животных. У животных, которым вводили препарат на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов на фоне экспериментального дисбиоза, практически отсутствовали различия по сравнению с контрольной группой в количественном составе условнопатогенной микрофлоры кишечника, что свидетельствует о нормализации численности этих видов микроорганизмов при применении суспензионной формы препарата.

Резюме

Исследован состав микрофлоры кишечника крыс при экспериментальном антибиотико-ассоциированном дисбиозе и после ее коррекции биопрепаратом на основе молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов. Полученные результаты свидетельствуют о нормализации численности микроорганизмов при применении суспензионной формы препарата и позволяют рекомендовать в клинической практике его применение для коррекции нарушений микрофлоры кишечника у животных.