Микроклональное размножение Citrus limon (L.) Osbeck сорта Павловский

Лимон является одной из важнейших сельскохозяйственных культур, которая все больше пользуется потребительским спросом на рынке. Его плоды богаты эфирными маслами, органическими кислотами, витаминами А, В, С, Р и могут использоваться в кондитерской, парфюмерной, консерв- ной отраслях [Капцинель, 1953; Егорова, 1981; FAO, 2013].

Климатические условия нашей страны не являются подходящими для разведения лимона, так как оптимальная температура для вегетационного периода составляет +20...+22 ° C [Самарина, Коломиец, 2009]. Однако с каждым годом увеличивается число любителей-цитрусоводов, среди которых наибольшей популярностью пользуются сорта

Павловский, Уральский, Майкопский.

Для получения качественных и здоровых сеянцев может быть использован метод микроклональ-ного размножения, который имеет немало преимуществ перед традиционными способами размножения. К таким преимуществам относятся высокий коэффициент размножения, возможность работать вне зависимости от времени года, получение генетически однородного потомства и без-вирусной базы, ювенилизация посадочного материала, которая является важной для адаптации к условиям in vivo [Сорокина, Старичкова, Решетникова, 2002; Черевченко, Лаврентьева, Иванников, 2008; Самарина, 2013].

Цель данной работы – оптимизация этапов микроклонального размножения лимона сорта Павловский.

Материал и методы исследования

Исследования проводились в 2017 г. в лаборатории микроклонального размножения кафедры ботаники и генетики растений и в Учебном ботаническом саду Пермского государственного национального исследовательского университета (ПГНИУ).

В качестве первичных эксплантов были использованы пазушные вегетативные почки лимона сорта Павловский с частью стебля длиной 1.3–2.2 см. Стерилизацию материала проводили следующим образом: раствор нейтрального детергента (25 мин.); промывка проточной водой (15 мин.); 96% этанол (5 сек.); 8% раствор гипохлорита натрия (20–30 мин.), с последующей промывкой в трех сменах стерилизованной дистиллированной воды (по 5 мин. в каждой).

На этапе введения в культуру и адаптации экспланты высаживались на питательные среды Мура-сиге и Скуга (MS) и КМО – МS с пониженным содержанием нитрата аммония (250 мг/л) без нитрата калия, но с добавлением сульфата аммония 1500 мг/л. [Murashige, Skoog, 1962], 2.5%-ной сахарозы, 0.7%-ного агар-агара. В среду добавляли регуляторы роста – нафтилуксусную кислоту (НУК), бензиламинопурин (БАП) и витамины: тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту. На этапе собственно микроразмножения использовалась среда DKW [Driver, Kuniyuki, 1984] с фитогормонами БАП и ГК (гибереллиновая кислота). На этапе укоренения микропобеги помещали на среду ½ МS с добавлением ауксинов – НУК 2.0 мг/л и ИУК 1.0 мг/л.

Стерилизация питательной среды проводилась в автоклаве Sanyo MLS-3780 при температуре 120°С, давлении 1 атм, в течение 15 мин. Все этапы микроразмножения проводились в стерильных условиях в ламинар-боксе. Экспланты содержали в условиях искусственного освещения (2790 люкс), период 14/10, при температуре + 20 ± 2°С. Часть растений, полученных в культуре in vitro, в декабре 2017 г. и в январе 2018 г. была перенесена в Учебный ботанический сад ПГНИУ, где выращивалась в условиях закрытого грунта.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программу Microsoft Office Excel. Различия по критерию Фишера считали статистически значимыми при p < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Микроклональное размножение лимона сорта Павловский проводилось в четыре этапа, выделение которых является общепринятым [Бутенко, Шевелуха, 1960].

Первый этап включал стерилизацию эксплантов и их посадку на твердую питательную среду MS. Стерилизация материала проводилась в три этапа с разной экспозицией в основном стерилизующем агенте (табл. 1).

Таблица 1

Выход стерильной культуры в зависимости от экспозиции в основном стерилизующем агенте

Основное стерилизующее вещество	Экспозиция, мин.	Выход стерильной культуры, %
Гипохлорит Na («Белизна»), 8%	15	49.2
	20	70.1
	25	58.4

Исходя из данных, представленных в табл. 1, можно сделать заключение, что для обработки экспланта 8%-ным раствором гипохлорита натрия необходимо не менее 20 мин. Разница с экспозицией в 15 мин. оказалась достоверной (p=0.04, p<0.05). Самый высокий процент выхода стерильной культуры отмечался при экспозиции 20 мин. – 70.1%. В работе О.В. Дорощёнка [2016] при использовании 10%-ного раствора гипохлорита Na в течение 15 мин. наблюдался примерно такой же процент выхода стерильной культуры – 68.2.

Результаты по развитию экплантов лимона на твердой питательной среде MS представлены в табл. 2.

Таблица 2

Выход жизнеспособных эксплантов на твердой питательной среде MS, %

Варианты среды	Жизнеспособные экспланты
MS+1.0 мг/л БАП+0.5 мг/л НУК	77.5
MS+1.0 мг/л НУК	63.6
MS+ 1.0 мг/л БАП	69.2
KMO+БАП 2.0 мг/л+ ГК 2.0 мг/л	47.3

При анализе результатов по развитию эксплантов лимона сорта Павловский на твердой питательной среде MS установлено, что оптимальной является среда с добавлением 1.0 мг/л БАП и 0.5 мг/л НУК, на которой получен самый высокий процент жизнеспособных эксплантов – 77.5. На среде КМО с добавлением 2.0 мг/л БАП и 2.0 мг/л

ГК наблюдался самый низкий процент выхода жизнеспособных эксплантов – 47.3. Разница между первым и четвертым вариантами среды оказалась достоверной (p=0.03, p<0.05). Полученные результаты отличаются от данных Л.С. Самариной [2013] по другим сортам лимона, у которых выход жизнеспособных эксплантов на среде КМО был высоким и составил 84.7%.

Начало роста микропобегов на первом варианте

Рис. 1 . Развитие экспланта лимона сорта Павловский на питательной среде MS+1.0 мг/л БАП+0.5 мг/л НУК

Вторым этапом является активация роста побегов с последующим микроразмножением. Культивирование проводилось на среде DKW с добавлением 2.0 мг/л БАП и 2.0 мг/л ГК. Через неделю наблюдалось возобновление роста, через 4–5 недель начиналось образование микропобегов. С каждого материнского экспланта удалось получить 2.45±0.78 дочерних микропобега.

Для укоренения микрочеренков была использована питательная среда MS с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей и сахарозы (½ MS), в двух вариантах: с добавлением 3.0 мг/л НУК и 1.0 мг/л НУК+1.0 мг/л ИУК. Результаты влияния ауксинов на ризогенез представлены на рис. 2.

Для оценки эффективности ризогенеза посчитывали частоту укоренения, то есть число корней на одном микропобеге. На первом варианте среды она составила 65.1% укорененных микропобегов с длиной корней 3.6±0.81 см и числом – 2.6±0.49 шт. на побег. На втором варианте среды наблюдалось 62.8% укорененных микропобегов с длиной корней 4.2±1.16 см и числом – 1.2±0.34 шт. на побег. В работе Л.С. Самариной [2013] для других сортов лимона наилучшей для укоренения была среда c добавлением 1.0–2.0 мг/л НУК и 1.0 мг/л ИМК. При этом процент укорененных побегов варьировал от 83.7 до 95.1. Длина корней составила 4.2–5.2 см, а число – 3.1–3.8 шт. на побег.

Растения, полученные в культуре in vitro, были перенесены в условия закрытого грунта Учебного ботанического сада ПГНИУ. Они были высажены среды наблюдалось через неделю после посадки, на втором и третьем – через 1.5 недели, на четвертом – через 2 недели. Появление первого листа отмечалось через 2–3 недели на первом варианте среды и через 3–4 недели – на остальных вариантах. Остановка роста эксплантов происходила через 5–7 недель после посадки вне зависимости от варианта среды. Развитие экспланта на питательной среде MS представлено на рис. 1.

в почвенный субстрат: торф, перлит, вермикулит, песок в соотношении 7:2:3:2. Выход адаптированных растений составил 87.5%.

1 вариант – ½ MS +3.0 мг/л НУК

2 вариант – ½ MS MS+1.0 мг/л НУК+1.0 мг/л ИУК

Рис. 2. Влияние ауксинов на ризогенез микрочеренков лимона сорта Павловский

Заключение

В результате проведенных исследований можно предложить следующую схему микроклонального размножения лимона сорта Павловский. На этапе введения в культуру можно использовать твердую питательную среду MS с добавлением 1.0 мг/л БАП и 0.5 мг/л НУК. На этапе микроразмножения хорошие результаты получены на среде DKW c добавлением БАП 2.0 мг/л и ГК 2.0 мг/л. Для этапа укоренения предлагается питательная среда ½ MS с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей и сахарозы с добавлением ауксинов 1.0 мг/л НУК+1.0 мг/л ИУК. Для перенесения в закрытый грунт можно использовать почвенный субстрат следующего состава: торф, перлит, вермикулит, песок в соотношении 7:2:3:2.