Микроклональное размножение пяти видов колокольчиков, произрастающих на территории ботанического сада им. Проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета

DOI:

На территории РФ и сопредельных стран насчитывается около 150 видов колокольчиков, из них 13 видов произрастают в средней полосе России. В основном все они относятся к редким, находящимся под угрозой вымирания видам, за счет действия антропогенного фактора (прокладка дорог, неконтролируемый сбор цветов, вырубка леса и др.). Поэтому сохранение как можно большего числа видов колокольчиков является весьма актуальной задачей. Для сохранения биоразнообразия в настоящее время наряду с традиционными методами используется способ сохранения редких и исчезающих видов растений в виде растущих коллекций в условиях in vitro. Цель настоящего исследования – получение активно пролиферирующих культур пяти видов колокольчиков, произрастающих на территории ботанического сада Воронежского госуниверситета для сохранения генофонда этих редких видов флоры России.

Материалы и методы

Исходными для получения стерильных культур были взяты растения следующих видов колокольчиков: Campanula rotundifolia L. (колокольчик круглолистный), Campanula persicifolia L. (к. персиколистный), Campanula trachelium L. (к. крапиволистный), Campanula rapunculoides L. (к. рапунцелевидный, или к. Гроссге_́йма, или к. репчатови_́дный), Campanula glomerata L. (к. скученный).

Стерилизацию первичного материала проводили в несколько стадий, учитывая то, что растения весной низкорослые, близко расположены к почве. Участки цветоносов с листьями протирали мыльной водой, нарезали на кусочки длиной по 5–7 см и помещали на 10 минут в раствор, содержащий каплю бытового моющего средства для равномерного смачивания поверхности растений. После этого стебли промывали: в проточной воде в тече- ние 20 минут, в дистиллированной воде 10 минут и стерилизовали в растворе, содержащем 4% бытового отбеливателя «Белизна» и 0.01–0.02% мертиолята (орто-этилртутьти-осалицилат натрия). Время стерилизации при непрерывном покачивании – 20 минут. Затем растения трижды (по 5 минут) отмывали в стерильной дистиллированной воде. Дополнительная стадия стерилизации включала помещение стеблей на 20–30 минут в раствор бензилпенициллина в концентрации 200 мг/л без последующего отмывания.

Стерильные части растения разрезали на сегменты, содержащие 1 – 2 пазушных почки, или использовали боковые листочки. Среды культивирования – Марасиге и Скуга (MS) [1], дополненная 1 мг/л бензиламинопурина (БАП), Woody Plant Medium (WPM) или ½ WPM [2], дополненные 0.2 мг/л БАП + 0.1 мг/л гиббереллина (ГА3). Укоренение осуществляли на ¼ MS, содержащей 1 мг/л индолилмас-ляной кислоты (ИМК), или 1 мг/л ИМК+1 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), или на без-гормональной ½ MS. Все работы проводили в стерильных условиях ламинар-бокса. Питательные среды содержали 7 г/л агара при рН 5.6–5.8, автоклавированы 20 минут при 1 атм.

Культивирование проводили на светокультуральных стеллажах в условиях 16-часового периода освещения светодиодными лентами напряжением 12 В, мощностью 4.5 Вт/м (3 светодиода на 10 см ленты), общая освещенность 2500–3000 люкс. На каждой полке добавлена лента с красными фотодиодами. Температура культивирования 23–26 ^оС. Результаты исследования и их обсуждение

Разработка научно-обоснованных методов размножения особо охраняемых и высоко декоративных растений, пользующихся повышенным спросом, для дальнейшего использо- вания в озеленении, а также создание генофондов сортов и видов растений в качестве активно растущих коллекции соответствует основным направлениям Государственной координационной программы развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года «БИО-2020», разработанной в соответствии с решением Правительственной комиссии по высоким технологиям и инновациям от 1 апреля 2011 г. О важности сохранения биоразнообразия свидетельствуют и другие документы мирового значения: Международная программа «DIVERSITAS» [3], принятая на Генеральной ассамблее Международного союза биологических наук при поддержке ЮНЕСКО, Международная Конвенция о сохранении биологического разнообразия [4].

В культуру ткани было введено 5 видов колокольчиков: Campanula rotundifolia L. (колокольчик круглолистный), Campanula persicifolia L. (к. персиколистный), Campanula trachelium L. (к. крапиволистный), Campanula rapunculoides L. (к. рапунцелевидный, или к. Гроссге_́йма, или к. репчатови_́дный), Campanula glomerata L. (к. скученный).

Основной проблемой культивирования травянистых растений является получение стерильного материала, поскольку они контаминируются почвой. Поэтому часто случается, что даже через несколько месяцев культивирования у базальных частей растений наблюдается выделение бактериальной инфекции. Ранее была разработана методика микроклонального размножения колокольчика твердолистного (Campanula sclerophylla Kolak) – исчезающего вида флоры Западного Кавказа [5]. В качестве первичного экспланта авторы использовали каудексы растения, а в качестве стерилизующих агентов – гипохлорит натрия или препарат «Велтолен».

В наших условиях оказалось недостаточным применение только агентов, содержащих хлор («Белизна») и ртуть (мертиолят), поэтому мы ввели дополнительный этап стерилизации – обработка растений раствором антибиотика. В статье Шестибратова К.А. с соавторами [6] по микроклональному размножению сирени указано, что растения культивируются на питательных средах, содержащих антибиотики в концентрации от 5 до 1000 мг/л. Однако помещение растений на среды инкубации, содержащие антибиотик, приводит к увеличению проявления сомаклональной изменчивости и другим негативным факторам развития. С целью выявления наибольшей эффективности при обработке растений нами были исследованы 4 коммерческих препарата антибиотиков: канамицин, бензилпенициллин, гентамицин, клафоран. Обработка антибиотиками не остается без последствий. Так, выяснилось, что однократная стерилизация канамицином (150–300 мг/л) вызывает в дальнейшем у микрорастений нарушение синтеза хлорофилла («смертельное отсутствие хлорофилла»), что приводит к появлению нежизнеспособных пятнистых или белых растений. Клафоран в тех же концентрациях (150–300 мг/л), которые применяются для уничтожения свободножи-вущих бактерий при генетической трансформации клеток, приводит к каллусообразованию и замедлению роста адвентивных побегов.

Действие гентамицина (150/300 мг/л) пролонгировано: после обработки антибиотиком растения начинают массово погибать в течение двух недель.

Поэтому оптимальной оказалась стерилизация растений раствором бензилпенициллина в концентрации 250 мг/л в течение 20 мин. Однако дополнение питательных сред этим антибиотиком в указанной концентрации приводило к постепенному некрозу тканей.

Так как колокольчики являются травянистыми растениями, то на начальных стадиях исследования была применена среда Мурасиге и Скуга, дополненная 1 мг/л БАП. Листочки без вдавливания помещали на поверхность агари-зованной среды, однако на протяжении двух месяцев не происходило процессов, характерных для более мясистых листьев других растений: разрастания тканей, образования адвентивных побегов [7]. Поэтому работа продолжилась по типу получения микрорастений из пазушных почек древесных: стебель разрезался на одноузловые сегменты, которые помещали на поверхность питательной среды. На полной среде WPM, дополненной 1 мг/л БАП, наблюдался значительный процент витрифицированных растений (таблица 1), тогда как на ½ или ¼ WPM развивались нормальные побеги, которые сильно кустились (рисунок 1а). Растения колокольчиков в условиях in vitro очень тоненькие, но даже в таком виде они могут образовывать бутоны и иногда начинать цвести (рисунок 1б).

Т а б л и ц а 1

Количество витрифицированных растений на разных питательных средах

% витрификации	Питательная среда, 20 суток инкубации
	MS	WPM	½ WPM	¼ WPM
	50	30	0	0

Укоренение у микрочеренков при помещении на среду ¼ MS, содержащую 1 мг/л ИМК, происходило в течение недели: на базальной части эксплантов образовывался клубок спутанных тонких корней (рисунок 1в). На среде MS, содержащей 2 гормона – ИМК и ИУК, образование корней шло в течение месяца, как и в безгормональных условиях. После образования корней пробирочные растения высаживали в почвосмесь, содержащую чернозем и нейтральный торф в соотношении 1:1, и помещали в минитеплицы (рисунок 2).

a – общий вид; б – цветок in vitro; в-образование корней

Рисунок 1. Образование адвентивных побегов и ризогенез на примере Campanula rotundifolia L. (колокольчик круглолистный)

Рисунок 2. Адаптированные к нестерильной почве 30-суточные растения колокольчика персиколистного

Одним из новшеств данной работы было использование на светокультуральных стеллажах в условиях 16-часового периода выращивания освещения не белыми люминесцентными лампами, а светодиодными лентами. На каждой полке добавлена лента с красными фотодиодами. Светодиоды имеют следующие преимущества: большой срок службы (до 20– 50 тысяч часов), малое потребление энергии и малое тепловыделение, что позволяет при большом количестве светокультуральных стеллажей поддерживать оптимальную температуру в растильнях (23–26 оС).

Использование светодиодных лент позволило снизить температуру в растильне, значительно уменьшить потребляемую мощность и улучшить световые условия для растений. Известно, что для жизнедеятельности растений важна красная составляющая солнечного спектра: лучи длиной 600–720 нм являются основными поставщиками энергии для фотосинтеза и влияют на процессы скорости и развития растений [8]. Именно этой цели служит одна полоса фотодиодов с красными лампочками.

Заключение

В данном исследовании по размножению пяти видов колокольчиков, относящихся к редким, исчезающим видам, удалось добиться стабильно пролиферирующей на протяжении полугода культуры. Отработаны методы получения стерильного материала, показаны различия в действии антибиотиков при поверхностной стерилизации на последующий рост и развитие растений. Отработаны схемы ризогене-за, получены большие количества укорененных эксплантов, пригодных для адаптации к нестерильным условиям. При необходимости получения плантационных количеств указанных колокольчиков, работа может быть проведена в короткие сроки.