Микромеханические ответы эритроцитов человека на стимулирование мембранных рецепторов, ионных каналов и ферментов

Механические свойства мембраны человеческих эритроцитов регулируются белками подмембранного цитоскелета, основными компонентами которого являются: альфа- и бета-спектрин, актин, полоса 4.1, аддуцин и дематин [15]. Все эти белки, кроме актина, фосфорилируются протеинкиназами, представленными в эритроцитах [9]. Кроме того, три двойных белок-белковых взаимодействия, такие как гликофорин С (ГФС) – белок полосы 4.1R, ГФС – р55 и р55 – 4.1R составляют тройной комплекс в эритроцитарной мембране [20]. Он является ответственным за проявление механических свойств мембраны, эластичности и стабильности клетки в целом [26]. При фосфорилировании белка полосы 4.1 происходит диссоциация указанного выше тройного комплекса, изменяется состояние цитоскелета и мембранной эластичности эритроцита (рис. 1) [8, 21]. Последняя определяет деформируемость эритроцита в целом и способность его эффективно участвовать в тканевой перфузии и доставке кислорода клеткам [1, 2, 6, 19].

Начальным этапом регуляторного пути при изменениях механических свойств является действие сигнальной молекулы на рецепторы, которые экспонированы на мембране зрелых эритроцитов [5, 11, 22, 25]. Действительно, при исследованиях in vitro в качестве мишеней для сигнальных молекул в эритроцитах могут быть рассмотрены рецепторы, ионные каналы и ферменты, представленные в клетках данного типа [10, 13, 15, 23]. Вместе с тем комплексных исследований изменения микрореологических свойств эритроцитов при активации мембранных рецепторов, ионных каналов и ферментов недостаточно.

Эритроцит

ГФ

ш

Актин

Полоса 4.1

Полоса 4.1

Спектрин

Актин

Диссоциация комплекса белков мембраны и прирост деформируемости

Спектрин

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая диссоциацию тройного комплекса: спектрин -актин - полоса 4.1 - гликофорин С мембраны эритроцита при фосфорилировании полосы 4.1 протеинкиназой, при активации мембранных белков-мишеней (рецепторов, ферментов или каналов). Обозначения: А - дефосфорилированное состояние полосы 4.1; Б - фосфорилированное состояние полосы 4.1; ГФ -интегральный белок мембраны эритроцита гликофорин С; К - мембранный канал;

Ф - ассоциированный с мембраной фермент; Р - мембранный рецептор

Учитывая вышесказанное, целью данного исследования было изучение микромеханических ответов зрелых эритроцитов человека на стимулирование мембранных рецепторов, ионных каналов и ферментов.

Материалы и методы

Цельную кровь получали венопункцией. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием (15 мин при 3000 об/мин), клетки трижды отмывали в изотоническом растворе хлорида натрия, содержавшем глюкозу (5,0 мМ), и ресуспендировали в растворе Рингера (рH – 7,4, осмолярность – 300 мОсм/л; определяли на осмометре Fogel ОМ -801, Германия) до гематокрита 40 % для последующей их инкубации с препаратами и регистрации их микрореологических свойств.

В первой серии эритроциты делили на четыре аликвоты и клетки инкубировали:

• 1)    с агонистом альфа-1 и бета-адренорецепторов мембраны эритроцитов: адреналином (1,0 µM);

• 2)    с агонистом альфа-1-адренорецепторов мембраны эритроцитов: фенилэфрином (1,0 µM);

• 3)    с агонистом бета-адренорецепторов мембраны: изопротеренолом (1,0 µM);

• 4)    только в растворе Рингера (без препарата) – контрольные образцы.

Во второй серии опытов эритроциты делили на четыре аликвоты и клетки инкубировали:

• 1)    с     неселективным     ингибитором     фосфодиэстераз     (ФДЭ):

изобутилметилксантином (ИБМК, 100 µM);

• 2)    с ингибитором фосфодиэстеразы-3: цилостазолом (10 µM);

• 3)    со стимулятором аденилатциклазы (АЦ): форсколином (10 µM);

• 4)    только в растворе Рингера (без препаратов) – контрольные образцы.

В третьей серии опытов эритроциты делили на четыре аликвоты и клетки инкубировали:

• 1)    со стимулятором входа кальция в эритроциты: кальциевым ионофором (А23186, 3,0 μМ);

• 2)    с блокатором кальциевых каналов: верапамилом (10 µM);

• 3)    с блокатором кальцийзависимых калиевых каналов: клотримазолом (10 µM);

• 4)    только в растворе Рингера (без препарата) – контрольные образцы.

Суспензии эритроцитов инкубировали с препаратами в течение 15 мин при 37 ºС. После инкубации эритроцитов регистрировали их микрореологические свойства: измеряли агрегацию, вязкость их суспензии (гематокрит 40 %) и степень деформируемости. Матричные растворы препаратов готовили в DMSO , этиловом спирте или в воде. Анализы были выполнены в течение 4 часов после взятия крови. Все препараты получены от фирмы « Sigma-Aldrich » (США).

Деформируемость эритроцитов исследовали двумя методами:

• 1.    Регистрировали вязкость суспензий эритроцитов с гематокритом 40 % ( Hct ) на полуавтоматическом капиллярном вискозиметре при высоком напряжении сдвига (2,45 Н∙м^–2). Все измерения выполнены при комнатной температуре (20,0 ± 1,0 ºС, поддерживалась путем кондиционирования воздуха). Вязкость суспензионной среды (изотонический раствор Рингера) была постоянной и составила 1,10 мПа с. Коэффициент вариации при измерении вязкости не превышал 1,0 %.

• 2.    Для оценки мембранной вязкоэластичности эритроцитов и их деформируемости в целом определяли индекс удлинения эритроцитов (ИУЭ) в проточной микрокамере, где создавали постоянное течение путем приложения

  Эритроциты, вытянутые напряжением сдвига потока жидкости

  
  
  

  Расчет индекса удлинения эритроцитов

  

  ИУЭ = ( L - W)/(L + W )

  
  

а                                б

Рис. 2. Эритроциты, закрепленные одной точкой к дну микрокамеры и вытянутые потоком жидкости (а). Расчет индекса удлинения эритроцитов как показателя их деформируемости (б). Стрелкой указано направление потока в микрокамере напряжения сдвига 0,98 Н^м-2. Микрокамеру заполняли суспензией эритроцитов (Hct = 0,5%). Суспензионной средой для них был раствор Рингера с добавлением декстрана-200 (10 % ХАЕС-стерил, Fresenius Kabi, Германия) соотношение: 30 % декстрана-200, 70 % - раствор Рингера. Вязкость этой жидкости составила 1,30 мПа-с. В микрокамеру подавали давление, которое вытягивало клетки, прикрепленные к дну камеры. На основе измерения длины (L) и ширины (W) вытянутых клеток (около 100 клеток) рассчитывали индекс удлинения эритроцитов (ИУЭ) как показатель их деформируемости (рис. 2):  ИУЭ = (L - W)/(L + W), автоматически, на основе специально написанной компьютерной программы (№ 2010613237  - номер регистрации в федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам).

Агрегацию эритроцитов оценивали с помощью агрегометра Myrenne M 1 (Германия), который дает возможность получить четыре индекса агрегации, при низких (3 с^-1) и высоких скоростях сдвига (600 с^-1). Кроме того, процесс агрегации контролировали методом прямой микроскопии с компьютерной регистрацией и анализом изображения.

Гематокрит определяли при помощи микрогематокритной центрифуги ( Elmi СМ -70).

Статистическая обработка экспериментальных данных

Весь цифровой материал обработан статистически с определением выборочной средней величины ( M ), величины среднего квадратичного отклонения ( ) и статистической ошибки средней ( m ). Проверку выборочного распределения на нормальность проводили с помощью теста Шапиро–Уилка. Если выборка подчинялась закону нормального распределения, достоверность различий в исследуемых группах определяли с помощью t -критерия Стьюдента. За уровень статистически значимых принимали изменения при p < 0,05. В тексте и таблице приведены средние величины ( М) и величины статистической ошибки средней ( m ).

Результаты

Изменения микрореологических характеристик эритроцитов при активации мембранных рецепторов

Имеются данные о том, что на мембране эритроцитов экспонированы альфа-1 и бета-адренорецепторы [11]. При инкубации с адреналином наблюдали умеренный прирост деформируемости эритроцитов на 6-8 % и выраженное увеличение их агрегации (на 34 %, таблица).

Альфа-1-адренорецептор сопряжен с кальциевым каналом [25]. При инкубации эритроцитов с фенилэфрином деформируемость эритроцитов достоверно не изменялась, хотя некоторое ее уменьшение наблюдалось, тогда как агрегация эритроцитов возросла в этих условиях на 53 % (таблица). Стимулирование бета-адренорецепторов изопротеренолом привело к существенному увеличению деформируемости эритроцитов на 19 % (р < 0,05), в то время как агрегация эритроцитов оказалась на 12 % ниже, чем в контроле (р <  0,05; таблица).

Изменения микрореологических характеристик эритроцитов при активации ферментов, расположенных в структурах мембраны эритроцитов

Прямая активация фермента мембраны аденилатциклазы (АЦ) с помощью форсколина сочеталась с приростом мембранной эластичности. На это указывало увеличение индекса удлинения эритроцитов на 17 % ( р < 0,05). При этом агрегация эритроцитов снизилась на 27 % (р <  0,05, таблица). С другой стороны, при ингибировании активности фосфодиэстеразы с помощью ИБМК был выявлен сходный с форсколином ответ эритроцитов. Так, индекс удлинения эритроцитов достоверно повышался на 11 %, а агрегация уменьшилась на 25 % (р < 0,05, таблица). ИБМК является неселективным ингибитором активности фосфодиэстеразы в клетках.

Изменение микрореологических показателей эритроцитов при их инкубации с препаратами

Показатель	ИУЭ, отн. ед.	г|с, мПа^с	ПА, отн. ед.
Препараты, действующие на мембранные рецепторы клеток ( M ± m , n = 26)
Контроль (без препарата)	0,218 ± 0,005	3,55 ± 0,09	7,34 ± 0,32
Адреналин (1,0 цМ)	0,236 ± 0,004*	3,34 ± 0,012	9,83 ± 0,36*
Фенилэфрин (1,0 цМ)	0,214 ± 0,005	3,48 ± 0,10	11,20 ± 0,42*
Изопротеренол (1,0 цМ)	0,259 ± 0,004*	3,15 ± 0,13*	6,46 ± 0,26*
Препараты, действующие на активность ферментов мембран клеток ( M ± m , n = 24)
Контроль (без препарата)	0,209 ± 0,005	3,62 ± 0,10	7,12 ± 0,22
Форсколин (10 цМ)	0,244 ± 0,004*	3,37 ± 0,012	5,22 ± 0,23*
ИБМК (100 рМ)	0,233 ± 0,006*	3,39 ± 0,10	5,34 ± 0,16*
Цилостозол (10 рМ)	0,238 ± 0,005*	3,29 ± 0,12*	5,46 ± 0,24*
Препараты, действующие на ионные каналы мембран клеток ( M ± m , n = 24)
Контроль (без препарата)	0,210±0,004	3,40±0,08	7,18±0,28
А23187 (3 рМ)	0,198±0,004*	3,48±0,012	12,78±0,54*
Верапамил (10 цМ)	0,243±0,005*	3,02±0,12*	5,88±0,25*
Клотримазол (10 цМ)	0,234±0,005*	3,19±0,10	7,36±0,22

Примечание : т|_с - вязкость суспензии эритроцитов; ПА - показатель агрегации эритроцитов; * - р < 0,05 относительно контроля.

Инкубация эритроцитов с цилостазолом - ингибитором фосфодиэстеразы-3 -привела к приросту деформируемости эритроцитов на 14 % и уменьшению их агрегации (на 23 %, p < 0,05). В этих условиях и вязкость суспензии эритроцитов достоверно снизилась на 9 % (см. таблицу).

Известно что кальций (Са2+) оказывает существенное влияние на механические свойства клеток [23]. Стимулирование его входа в эритроциты при помощи ионофора А23187 сопровождалось выраженным приростом агрегации эритроцитов и небольшими негативными изменениями деформируемости (см. таблицу).

С другой стороны, блокирование входа Са2+ в эритроциты с помощью верапамила привело к увеличению ИУЭ на 16 % по сравнению с контролем, а также к снижению вязкости суспензии и агрегации эритроцитов на 11 и 18 % соответственно (см. таблицу). На механическом поведении эритроцитов может сказаться и потеря калия (K+) через кальцийактивируемые К+-ионные каналы (Гардош-каналы [12]). Блокирование этих каналов клотримазолом положительно сказалось на деформируемости эритроцитов и мало повлияло на их агрегацию (см. таблицу).

Обсуждение результатов

Вне- и внутриклеточный сигнальный путь, ассоциированный со срочным изменением пластичности мембран эритроцитов и деформируемости клетки в целом, включает: активацию мембранного рецептора при связывании лиганда, изменение состояния G -белков, активацию АЦ, продукцию цАМФ и стимулирование цАМФ-зависимой протеинкиназы А (ПКА) [22]. Известно, что на мембране человеческих эритроцитов представлены как альфа-1, так и бета-1- и -2-адренорецепторы [5, 11, 24, 25]. Полученные нами данные показали, что бета-агонист изопротеренол существенно изменял микрореологические свойства эритроцитов. Поскольку бета-адренорецепторы сопряжены с Gs -белками, активирующими фермент - аденилатциклазу [27], то можно ожидать такого же эффекта от ее прямого стимулирования. Форсколин -специфический симулятор АЦ [17] - достоверно увеличивал деформируемость эритроцитов и снижал их агрегацию. Роль фермента аденилатциклазы заключается в повышении продукции цАМФ в клетках [14]. Поэтому можно полагать, что положительные изменения микрореологических свойств эритроцитов и повышение их текучести связаны с приростом концентрации цАМФ. При инкубации эритроцитов с проникающим аналогом цАМФ были получены изменения, сходные с действием форсколина и другого стимулятора АЦ - простагландина Е 1 [18]. Конечным звеном этого регуляторного каскада является фосфорилирование белков мембраны протеинкиназой А (ПКА), что ведет к изменению ее механических свойств. Было показано, что фосфорилирование белка полосы 4.1 при помощи ПКА сопровождается позитивным изменением деформируемости эритроцитов [4]. С другой стороны, активация Са²⁺-сигнального пути (в наших опытах при инкубации эритроцитов с кальциевым ионофором), вероятно, сопровождалась интенсификацией формирования белкового комплекса с участием спектрина, актина, полосы 4,1 и интегральных белков - полосы 3 и ГФС [3]. Известно, что при концентрации Са²⁺ выше 100 цМ происходит снижение деформации эритроцитов [22, 26]. Было показано, что блокирование входа Са²⁺ в клетку верапамилом, напротив, повышает деформируемость эритроцитов и текучесть их суспензий. Сходный эффект наблюдали при ингибировании Гардош-эффекта [12] с помощью клотримазола. Возможно, прирост деформируемости каким-то образом связан с обменом К⁺. Так, было установлено, что происходит диссоциация тройного комплекса актин - спектрин - полоса 4.1 цитоскелета мембраны эритроцита при повышении концентрации KCl выше 100 мМ.

эритроцитов        эритроцитов

Рис. 3. Усредненные данные (в каждом случае по трем препаратам) изменений деформируемости эритроцитов и показателя их агрегации при активации или ингибировании: мембранных рецепторов эритроцитов; ферментов мембраны и ионных каналов мембраны

Другой эффект ингибирования активности Гардош-каналов может быть связан с повышением обмена К+ и воды в эритроцитах и сохранением ими двояковогнутой формы [7]. Это может обеспечить их оптимальную деформируемость [19].

Сравнительный анализ показал, что наиболее существенно деформируемость эритроцитов изменяется при активации/ингибировании исследованных ферментов мембраны эритроцитов (рис. 3). В среднем по всем трем препаратам (форсколин, ИБМК и цилостазол) прирост деформируемости эритроцитов составил 14 %, что несколько больше, чем при активации рецепторов и ионных каналов (см. рис. 3).

Что касается агрегации эритроцитов, то она в большей степени изменялась при активации или ингибировании активности ионных каналов (см. рис. 3).

Выводы

• 1.    Микромеханические свойства эритроцитов статистически достоверно изменяются под влиянием активации или ингибирования элементов молекулярных сигнальных каскадов клеток (рецепторов, ферментов и ионных каналов).

• 2.    Наиболее существенные изменения деформируемости эритроцитов наблюдаются в условиях активизации аденилатциклазного сигнального пути, поскольку при активации его элементов были получены наибольшие изменения деформируемости эритроцитов. Так, стимулирование бета-адренорецепторов изопротеренолом сопровождалось приростом деформируемости на 19 %, активации аденилатциклазы форсколином – на 17 %, ингибирования активности фосфодиэстераз цилостазолом – на 14 %.

• 3.    Что касается агрегации эритроцитов, то она также существенно снижалась при активации указанного выше молекулярного сигнального пути, а повышение агрегации эритроцитов связано с поступлением Са²⁺ в эритроциты через соответствующие мембранные каналы.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 14-04-01703-а, и гранта № 243 Минобрнауки.