Микросателлитные локусы для идентификации сортов льна масличного селекции ВНИИМК: подбор информативных праймеров и оптимальных условий ПЦР ДНК

Введение. Лен масличный – ценная техническая культура. В семенах современных сортов льна масличного содержится около 50 % быстро высыхающего масла, которое используют в различных отраслях промышленности и в медицине. Оно высоко ценится в производстве лакокрасочных материалов. Возрождается интерес к использованию льняного масла в пищу в связи с его лечебно-профилактическими свойствами. Льняное масло содержит высокую долю α-линоленовой кислоты, которая способствует снижению в организме уровня холестерина, улучшению жирового и белкового обмена, уменьшает вероятность образования тромбов и опухолей [1].

Лен экологически пластичная культура, с широким ареалом возделывания, что обусловлено его высоким потенциалом в отношении тепло- и влагообеспеченности [2]. По прогнозу к 2020 г. в России культурой может быть занято до 1 млн га [3]. Перспектива увеличения площади посева культуры является одним из стимулов для создания новой линейки сортов. Программа селекции льна предусматривает скрещивание соответственно подобранных родительских форм. Успех селекции во многом определяется разнообразием исходного материала. Выявить генетическое разнообразие и определить потенциал продуктивности исходного и селекционного материала льна возможно сопоставлением различий в нуклеотидных последовательностях ДНК. В работах по изучению генетического разнообразия, идентификации сортов наиболее распространенными и высокоэффективными являются маркерные системы, основанные на вариабельности микросателлитных последовательностей генома [4]. Микроса-теллитные локусы – это в основном, некодирующие участки ДНК, в них могут 42

накапливаться мутации, что обусловливает высокий полиморфизм этих зон. Чаще всего они обладают кодоминантным типом наследования. Такие простые повторы широко распространены в геномах растений. SSR-маркеры позволяют идентифицировать разнородный сортовой материал, устанавливать филогенетические связи, вычислять генетические дистанции между сортами для подбора родительских пар [5; 6; 7; 8]. Этот вид маркеров широко используется в генетических исследованиях льна. Первая генетическая карта генома льна на основе SSR-локусов включает 24 группы сцепления со 113 маркерами, охватывающими 833,8 сМ [9]. Полиморфизм сортов льна выше, чем у сортов пшеницы, ячменя и сои. Степень полиморфизма в коллекциях образцов существенно варьирует в зависимости от числа исследованных генотипов и их генетического разнообразия [10]. Лен, как культурное растение, имеет большую базу данных микросателлитных локусов. Описано 10306 SSR-маркеров, что выгодно отличает его от других сельскохозяйственных культур [11]. Xin Deng c соавторами (2011) создали геномную библиотеку льна, охарактеризовали 206 нуклеотидных последовательностей, содержащих микросателлиты. При оценке восьми культурных сортов льна, происходящих из различных стран, 38 микроса-теллитных локусов проявили себя как полиморфные [12]. На основе полиморфизма микросателлитных локусов составлена система, позволяющая проводить генотипирование образцов льна, сложно различимых или неотличимых друг от друга при морфологическом анализе [10]. Но при использовании системы молекулярных маркеров, созданной для определенной коллекции генетических образцов, генетическом окружении и условиях окружающей среды, её необходимо апробировать на способность предсказывать генотип в отличающихся условиях [13; 14].

Поскольку молекулярно-генетическое разнообразие исходного и селекционного материала коллекции льна селекции ВНИИМК ранее не изучалось, целью данной работы является подбор информативных микросателлитных локусов и оптимальных условий ПЦР ДНК для создания молекулярно-генетических паспортов льна.

Материалы и методы. Материалом для исследования служили 8 сортообраз-цов льна масличного из конкурсного сортоиспытания (КСИ) лаборатории селекции льна ВНИИМК: ВНИИМК 620, К4193, К4194, К4195, К4196, К4197, К4198, К4199. Семена каждого образца сеяли в пластиковый сосуд и выращивали растения до стадии «елочки», в условиях камеры искусственного климата Биотрон-5. Из двух растений каждого образца выделяли ДНК. Изоляцию и очистку ДНК проводили методом Saghai-Maroof et al. с использованием СТАВ-буфера [15]. Для проведения работы были выбраны 10 микросателлитных локусов, которые при оценке набора из восьми сортов культурного льна различного происхождения имели PIC (индекс полиморфного информационного содержания) в пределах 0,525– 0,881 с числом аллелей от 4 до 12 [12]. Нуклеотидные последовательности праймеров, фланкирующих SSR-локусы, синтезированы фирмой «Синтол» (Москва).

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мM сульфата аммония, 3 мM MgCl 2, 0,01 %-ный Tween 20, 0,2 мM каждого из дезоксирибонуклеозидфосфатов, 10 пМ праймера, 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Си-бэнзим, Москва). Амплификация проходила в термоциклере S1000^тм (BioRad, США) при следующих условиях: начальная денатурация при 95 ^оС в течение 2 мин; затем 30–35 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 58–60 ^оС в течение 40 с, элонгация – 1 мин при 72 ^оС, денатурация при 94 ^оС – 30 с, финальная элонгация – 2 мин. Температуру отжига подбирали в соответствии с нуклеотидной последовательностью праймеров.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в 8 %-ном акриламидном геле, приготовленном с применением 1 х ТБЕ буфера, использовали камеры для вертикального электрофореза (VE-20, ДНК-технология, Россия). Окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализировали и документировали результаты электрофореза, используя систему цифровой документации BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). Размер фрагментов ДНК определяли с использованием программного обеспечения Bio-Capture (Vilber Lourmat, Франция) относительно маркера длины фрагментов ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific.

Индекс информационного полиморфного содержания (PIC) [16] и эффективное число аллелей (n e ) [17] вычисляли по формулам:

PIC i = 1 - ∑      ij ²,      (1)

n e = 1/ ∑       ij ²,         (2)

где – Р частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов.

Результаты и обсуждение . В результате работы для каждой из 10 пар праймеров, в соответствии с их нуклеотидной последовательностью, был произведен подбор оптимальной температуры отжига. Она составила от 58 до 60 ^оС. ПЦР ДНК с данными праймерами выявила 11 микросателлитных локусов у 8 генотипов льна. Праймерные последовательности для мотивов (TTC)4 и T(TTC)18, фланкирующие локус Lu 21 [12], амплифициро-вали два локуса, обозначенные как Lu 21 и Lu 21 ´ (рис. 1).

Lu 21  ___„

Рисунок 1 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК образцов льна масличного по локусам Lu 21 и Lu 21´.

М – маркер молекулярной массы 100 пн.

Учитывая набор амплифицированных фрагментов ДНК и определив их размер, получили характеристики аллельного состава образцов (табл. 1) .

Таблица 1

Аллельный состав образцов льна масличного по 11 SSR-локусам

Образец	Локус
	Lu 1	Lu 3	Lu 7	Lu 8	Lu 9	Lu 10	Lu 11	Lu 21	Lu 21´	Lu 24	Lu 25
К4193	160	160	150	110	110	156	112	150	109	105	169
К4194	160	160	150	110, 170	110	165	112	150	109	105	116, 169
К4195	160	160	150	170	110	148	112	150	104	105	169
К4196	160	160	150	170	110	148	112	150	104	105	169
К4197	160, 163, 182	160, 165, 273, 244	145	170	110, 164	165	112, 161	145	109, 118	105, 156	169
К4198	163	160	145	170	164	165	161	145	109	156	169
К4199	163	165	145	170	164	148	161	145	104	163	169
ВНИИМК 620	158	160	135, 150	110	110	138	112	136, 150	118	115	169

Анализированные образцы в основном отличались по аллельному состоянию локусов (табл. 1). Только два генотипа К4196 и К4195 по одиннадцати локусам имели сходный аллельный состав. Для их идентификации и последующего генотипирования коллекции сортов льна масличного следует увеличить количество локусов.

Мономорфных локусов обнаружено не было. По два аллеля выявлено для локусов Lu 8, Lu 9, Lu 11, Lu 25, по три – для Lu 7, Lu 21, Lu 21´ и по 4 – для Lu 1, Lu 3, Lu 10, Lu 24. В целом, с помощью 10 пар SSR-праймеров выявлено 11 полиморфных локусов, которые в совокупности амплифицировали 33 аллеля размером от 104 до 273 пар нуклеотидов. В зависимости от локуса число аллелей варьировало от 2 до 4 (в среднем 3 аллеля на локус). Эффективное число аллелей n e составило от 1,42 до 3,22, в среднем 2,08, а значение индекса полиморфного информационного содержания PIC – от 0,30 до 0,69, в среднем 0,49 (табл. 2).

Работа проведена на наборе микроса-теллитных локусов, которые при испытании на восьми сортах культурного льна, происходящего из различных стран (Канада, Эфиопия, Китай, США и Франция), 44

проявили себя высокоинформативными: PIC для данной коллекции составил от 0,59 до 0,88 [12] . Общеизвестно, что степень полиморфизма может существенно варьировать в зависимости от числа исследуемых генотипов и их генетического разнообразия [10]. Сортообразцы, использованные в нашей работе, взяты из КСИ, и их количество невелико. Это объясняет тот факт, что показатели информативности SSR-локусов, полученные для коллекции образцов льна ВНИИМК, несколько ниже, чем заявлены в работе Xin Deng (2011) [12].

Таблица 2

Показатели информативности

SSR-локусов, использованных в работе

Локус	Число аллелей		PIC
	наблюдаемое	эффективное
Lu 1	4	2,32	0,57
Lu 3	4	1,42	0,30
Lu 7	3	2,22	0,55
Lu 8	2	1,72	0,42
Lu 9	2	1,72	0,42
Lu 10	4	3,22	0,69
Lu 11	2	1,72	0,42
Lu 21	3	2,22	0,55
Lu 21´	3	2,56	0,61
Lu 24	4	2,43	0,59
Lu 25	2	1,42	0,30
Среднее	3	2,08	0,49

Несмотря на то, что механизм цветения и опыления обеспечивает преимущественное самоопыление цветков льна и блокирует возможность перекрестного опыления, его возможность полностью не исключается [1]. Это может приводить к гетерогенности образцов. Кроме биологического загрязнения, возможно наличие механической примеси семян другого сорта. Использованный набор локусов дал возможность обнаружить генетическую неоднородность некоторых изученных образцов. ДНК проростков К4194, К4197, ВНИИМК 620 показала различия в аллельном составе. Образец ВН620 полиморфен по локусам Lu 7 и Lu 21. Образец К4197 неоднороден по локусам Lu 1, Lu 3, Lu 9, Lu 11, Lu 21´ и Lu 24, К4194 – по локусам Lu 8 и Lu 25 (рис. 1, 2).

Рисунок 2 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК образцов льна масличного по локусу Lu 9. Дорожки:

1, 2 – К4194; 3, 4 – К4193; 5, 6 – К4198;

7, 8 – К4197; 9, 10 – К4196; 11, 12 – К4195;

13, 14 – К4199; 15, 16 – ВНИИМК 620, М – маркер молекулярного веса

В образцах К4193, К4198,  К4196,

К4195, К4199 не выявлено различий между растениями.

Заключение. В результате апробации 10 пар праймеров, описанных в литературе как фланкирующие микросателлитные участки ДНК льна масличного, применительно к восьми сортообразцам культуры коллекции ВНИИМК выявлено 11 полиморфных локусов. В зависимости от локуса число аллелей варьировало от 2 до 4 (в среднем 3 аллеля на локус). Эффективное число аллелей n e составило от 1,42 до 3,22, а значение индекса полиморфного информационного содержания PIC – от 0,30 до 0,69. Из восьми образцов три оказались генетически неоднородными. Проанализированные образцы в основном различались по аллельному состоянию локусов, но два генотипа – К4196 и К4195 – по 11 SSR-локусам имели неотличимый аллельный состав. Таким образом, изученные маркеры могут быть использованы для создания молекулярно-генетических паспортов и определения генетической однородности сортов льна масличного селекции ВНИИМК. Однако их недостаточно для различения близкородственных генотипов. Необходимо провести дополнительную апробацию других маркеров, обладающих высоким уровнем полиморфизма.