Моделирование динамики межфазного натяжения на границе углеводород - вода при образовании кластеров актинобактерий

Актинобактерии рода Rhodococcus (рис. 1) являются представителями важной эколого-трофической группы микроорганизмов, окисляющих природные и антропогенные углеводороды и, следовательно, участвующих в биогеохимических циклах углерода и восстановлении загрязненных углеводородными ксенобиотиками экосистем [2]. Родококки способны к окислительной деструкции практически всех углеводородных компонентов нефти: алканов, циклических и ароматических углеводородов и их производных, сложных поли- и гетероциклических соединений. Отдельные представители рода Rhodococcus используются в составе биопрепаратов, предназначенных для биоремедиации нефтезагрязненных сред [12].

а                            б

Рис. 1. Колонии ( а ) и клетки ( б ) родококков [2]

Начальным этапом процесса биодеструкции углеводородных соединений является бактериальная адгезия, интенсивность которой определяется гидрофобностью клеток и их адгезивной активностью. Бактериальная адгезия к жидким углеводородам рассматривается отдельными авторами [13, 16] как механизм образования биопленок в водно-углеводородных средах. Например, в работе [13] исследована динамика комплексного процесса пленкообразования, сопряженного с биодеструкцией полихлорированных бифенилов смешанной культурой микроорганизмов. В ряде исследований описаны математические модели бактериальной адгезии к твердым субстратам [9, 17], формирования биопленок на границе твердый субстрат – жидкость [7, 8] и жидкая среда – воздух [6], а также процессов биофильтрации газообразных выбросов и очистки сточных вод от углеводородных загрязнителей с применением биопленок [1, 3]. Однако в литературе отсутствуют модели процесса биопленкообразования в двухфазной системе несмешивающихся жидкостей.

С использованием метода высокоточной межфазной тензиометрии исследована термодинамика адгезионного процесса и экспериментально подтвержден сорбционный механизм формирования биопленок родококками в водно-углеводородной системе [4, 5]. Цель настоящей работы – математическое моделирование процессов формирования и разрушения клеточных кластеров Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 на основе экспериментальных данных по динамике межфазного натяжения на границе, разделяющей бактериальную суспензию и жидкий углеводород ( н -гексадекан либо н -додекан).

Экспериментальное исследование динамики межфазного натяжения в системе углеводород – бактериальная суспензия

Определение поверхностного (межфазного) натяжения в системе углеводород– вода проводили методом отрыва кольца на высокоточном автоматическом тензиометре Sigma 701 ( KSV Instruments , Финляндия) при температуре 25 ± 0,2 ^оС в течение 15–24 ч. Регистрацию результатов измерения осуществляли с использованием программного обеспечения « WinSigma » ( KSV Instruments , Финляндия). В работе использовали штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains.html ). Готовили водные суспензии отмытых от питательной среды клеток родококков в различных концентрациях, соответствующих показателям оптической плотности (ОП 600нм ) 0,25–2,0 (ОП – безразмерная величина, характеризующая степень погашения света, прошедшего через слой материала), измеряемым с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 ( Perkin-Elmer , США) при длине волны 600 нм. В качестве контроля использовали систему вода – н -гексадекан ( н -додекан) без добавления клеток.

Результаты долгосрочных экспериментов по определению динамики межфазного натяжения в системе вода – н -гексадекан при различных концентрациях клеток в суспензии представлены на рис. 2. Как видно из рис. 2, равномерное снижение показателя межфазного натяжения до стабильного минимального значения наблюдалось при низкой (ОП 600нм = 0,5) концентрации бактериальной суспензии. В то же время при средних (0,75–1,0) значениях ОП 600нм был зарегистрирован скачкообразный характер кривой межфазного натяжения после 4,5–6 ч взаимодействия клеток с н -гексадеканом, что, по-видимому, свидетельствует о постепенной стабилизации процесса адсорбции родококков в межфазном слое. Такое же скачкообразное колебание межфазного натяжения клеточной суспензии при

Время, ч

Рис. 2. Динамика межфазного натяжения суспензии клеток R. ruber ИЭГМ 231 в системе вода – н -гексадекан. Значения ОП_600нм клеточных суспензий: 0; 0,5;

0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,25

ОП 600нм = 1,25 наблюдалось уже с первых минут в течение 8 ч эксперимента. При этом после 9 ч взаимодействия бактериальных клеток с н -гексадеканом показатели межфазного натяжения приобретали стабильный характер (28–30 мН/м), что указывает на предельное насыщение межфазного слоя клетками родококков и формирование межклеточных контактов. Стабильно низкие значения межфазного натяжения регистрировались на протяжении всего эксперимента при использовании высококонцентрированных (ОП 600нм = 1,5–2,25) клеточных суспензий.

Для исследования влияния природы углеводородного субстрата на динамику процесса адгезии клеток в двухфазной системе была проведена серия аналогичных экспериментов с н -додеканом (рис. 3), характеризующимся меньшей гидрофобностью, чем н -гексадекан, и, соответственно, большей растворимостью в воде. Как видно из рис. 3, в системе с н -додеканом наблюдалась сходная динамика межфазного натяжения в зависимости от концентрации клеток родококков. Скачкообразный участок кривой межфазного натяжения с последующим достижением минимального значения (27 мН/м) регистрировался при наиболее низкой (ОП 600нм = 0,25) исследуемой концентрации бактериальной суспензии. При использовании суспензии клеток в концентрации, соответствующей ОП 600нм = 0,5, не удалось зарегистрировать стабильных показателей межфазного натяжения на протяжении всего эксперимента. Стабилизация значений межфазного натяжения на минимальном уровне в системе с н -додеканом происходила при меньшей концентрации клеток (ОП 600нм = 1,25) по сравнению с таковой в опытах с н -гексадеканом.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что родококки на границе раздела фаз вода – углеводород проявляют свойства поверхностно-активных частиц, сорбируясь на межфазной поверхности и понижая межфазное натяжение системы в концентрационно-зависимой манере до достижения минимального значения, соответствующего предельной сорбции клеток. При этом в насыщенном сорбционном слое клеток происходят образование межклеточных контактов и инициация формирования бактериальной биопленки. Инициация формирования биопленки

Рис. 3. Динамика межфазного натяжения суспензии R. ruber ИЭГМ 231 в системе вода – н -додекан. Значения ОП_600нм клеточных суспензий: 0; 0,25; 1,25; 2,0

в системе вода – н -додекан начинается при меньших концентрациях клеток в суспензии, что, по-видимому, обусловлено термодинамическими свойствами данной системы. Вероятно, площадь раздела фаз возрастает с увеличением дисперсности системы, поэтому площадь контакта клеток с н -додеканом выше по сравнению с таковой в системе с н -гексадеканом, и клетки родококков за более короткое время адсорбируются на доступной поверхности. Замечено, что стабильные показатели межфазного натяжения клеточной суспензии были примерно одинаковы (27–30 мН/м) независимо от природы углеводородного субстрата. Таким образом, снижение показателей межфазного натяжения в двухфазной системе обусловлено участием гидрофобных взаимодействий между бактериальными клетками и углеводородом. Полученные экспериментальные данные могут быть использованы для регуляции роста бактериальных биопленок в жидких гетерофазных системах.

Детерминистическая биомеханическая модель зависимости ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ ОТ ВРЕМЕНИ

Обозначим через n(t) временную зависимость концентрации клеток на межфазной границе. Будем считать, что эта зависимость имеет стандартный релаксационный вид n (t) = П1 (1 - exp (-t^i)), где n1 – максимально достижимая концентрация, t1 – некоторое характерное время. Зависимость поверхностного натяжения а от концентрации предполагаем имеющей вид

a(n) = а0 -(а0 - а1(s(n)) ) —, n1 где a1(s) = a10 -(а10 -а11)s , a0, aw, ап - некоторые характерные значения a, а величину 0 < s < 1 можно назвать степенью образования единой пленки [13, 16, 17] на межфазной границе. Для зависимости s(n) примем следующую феноменологическую формулу:

, х 11  . n - — s (n) = — + — arctg ----2 ,

2 n ^ n 3 v где n2 и n3 – некоторые характерные значения n.

Сравнивая получившуюся в итоге теоретическую зависимость a ( t ) (без учета случайных вариаций) с экспериментальной зависимостью при ОП 600 нм = 0,75, находим методом наименьших квадратов параметры t 1 , a ₀ , a ₁₀ , a_n, n ₂ , n 3 . Теоретическая и экспериментальная зависимости сопоставлены на рис. 4, а .

Вероятностная биомеханическая модель зависимости ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ ОТ ВРЕМЕНИ

Вероятностная модель учитывает случайный характер процесса образования единой пленки бактерий. Пусть степень образования этой пленки есть случайная величина, равномерно распределенная на отрезке [ s ( n ) - Д ( n ), s ( n ) + Д ( n ) ] , где

Д ( n ) = k ( n )min( s ( n ), 1 — s ( n )) , k ( n ) = <

'1,7 0

( n <  0,985),

( n >  0,985)..

а

б

Рис. 4. Экспериментальная зависимость σ( t ) (ОП_600нм = 0,75) и соответствующая теоретическая зависимость, не учитывающая ( а ) и учитывающая ( б ) случайные вариации

Получившаяся теоретическая зависимость (одна из реализаций вышеупомянутой случайной величины) и экспериментальная зависимость при ОП 600 нм = 0,75 сопоставлены на рис. 4, б .

Рис. 5. Пример кластера: а – скопление бактерий; б – наибольший кластер

Рис. 6. Зависимость s ( t ) в модели формирования и разрушения кластеров

Далее вероятностная модель была дополнительно усложнена. Феноменологические формулы для s(n) и Δ(n) получили объяснение на уровне следующей микромодели. Предполагалось, что по мере накопления клеток на межфазной границе они объединяются в кластеры [10, 11, 15]. Моделирование кластерообразования проводилось по схеме клеточных автоматов. Если одна из соседних клеток данной клетки входит в уже имеющийся кластер, то в него включается и данная клетка. Кластеров может быть много, и среди них можно выделить наибольший (рис. 5). Доля клеток, входящих в наибольший кластер, растет со временем, при этом зависимость этой доли от концентрации клеток качественно соответствует приведенной выше феноменологической зависимости s(n). Поэтому можно считать, что доля клеток в наибольшем кластере и есть степень s образования единой пленки. Тогда отпадает необходимость в использовании искусственной феноменологической зависимости s(n). Далее случайные вариации величины s могут быть объяснены следующим образом. Измерительное кольцо, проходя межфазную границу, разрушает встретившийся кластер с некоторой вероятностью [7, 14]. Если наибольший кластер еще не очень велик, то к следующему проходу измерительного кольца он не успевает восстановиться, и величина s остается малой, а поверхностное натяжение – большим. С течением времени наибольший кластер растет и поэтому успевает восстановиться к следующему проходу кольца; тогда величина s устанавливается близкой к единице и поверхностное натяжение становится малым. В промежуточном случае наблюдаются случайные колебания значений s. В итоге отпадает необходимость в использовании искусственной феноменологической зависимости Δ(n), а зависимость s(t) имеет вид, показанный на рис. 6, т.е. совпадает с использованной при получении теоретической зависимости на рис. 4, б. Тем самым эта зависимость сохраняется, но объяснена теперь посредством микромодели формирования и разрушения кластеров бактерий.

Заключение

Проведено экспериментальное и теоретическое исследование динамики снижения межфазного натяжения в результате адсорбции клеток R. ruber ИЭГМ 231 на границе, разделяющей бактериальную суспензию и жидкий углеводород ( н -гексадекан либо н -додекан). Выполнено математическое моделирование начального этапа образования биопленки на основе математического описания процессов формирования и разрушения клеточных кластеров. Установлено, что экспериментально наблюдаемая зависимость межфазного натяжения в системе бактерии – вода – углеводород от времени носит нерегулярный характер, поэтому детерминистическая модель может лишь качественно описать эту зависимость. Более точное соответствие между теорией и экспериментом может быть достигнуто с помощью вероятностной модели. Разработанная микроуровневая модель основана на теории насыщения адсорбционного слоя бактерий на поверхности раздела фаз и образования единой биопленки на межфазной границе углеводород – вода. В этой модели предложено теоретическое объяснение выявленной скачкообразной динамики межфазного натяжения, обусловленной прохождением измерительного кольца через формируюшуюся биопленку и случайным характером формирования – разрушения клеточных кластеров до достижения термодинамически стабильного состояния системы. Эта модель качественно и количественно описывает основные черты рассматриваемого явления. Модель допускает дальнейшее развитие, которое должно состоять в более подробном анализе механизмов поведения бактериальных клеток на границе раздела фаз.

Благодарности

Исследования выполнены в рамках госзаданий 6.3330.2017.4.6 (ПГНИУ), 01201353246 (ИЭГМ УрО РАН) и поддержаны грантом РФФИ 18-29-05006.