Моделирование гидролиза животного белка эндопротеазами in silico

Ежегодно в процессе промышленной переработки сельскохозяйственной продукции производится большое количество пищевых побочных продуктов животного происхождения, которые обычно используются в качестве корма для непродуктивных животных [1, 2].

Мясные субпродукты являются хорошим источником биоактивных пептидов, полученных из белковых гидролизатов при воздействии коммерческих протеаз [3].

В настоящее время существует большой интерес к использованию биоактивных пептидов в функциональных продуктах питания, способствующих укреплению здоровья [4]. Авторами классифицированы биологически активные пептиды, получаемые из продуктов питания, такие как противораковые, противодиабетические, антигипертензивные, противомикробные, снижающие уровень холестерина и другие [5–7].

Кроме того, следуя аналогичной тенденции, используемой при исследовании других гидролизатов, таких как гидролизаты молочного, растительного белка, содержащие производные биоактивных пептидов с широким спектром биологических свойств, разработка гидролизатов животного происхождения представляет собой актуальную задачу для ученых, пытающихся определить связь между химической структурой пептидов и их биологической активностью [8].

В пищевой промышленности ферментативный гидролиз является наиболее распространенным методом, используемым для высвобождения пептидов из белков, в котором обычная тепловая обработка используется в качестве предварительной для усиления гидролитического действия [9].

Гидролиз in silico работает в соответствии с предположением, что все расщепляемые пептидные связи в определенном белке будут доступны для фермента и будут легко гидроли-зованы [10–12].

Преимуществом исследований in silico является экономия времени и реагентов, а также возможность выявления того, какие пептиды имеют биологический потенциал. Для оценки прогнозирования биологической активности пептидов используются соответствующие базы данных, позволяющие искать точное соответствие интересующей аминокислотной последовательности [13–14].

В связи с вышеизложенным целью работы было использование методов in silico при расщепления животного белка протеазами и прогнозирование биологической активности образованных пептидов для их дальнейшего изучения.

Материалы и методы исследования

С помощью программного обеспечения PeptideCutter были предсказаны вероятные места расщепления белка выбранными ферментами в наиболее специфичных последовательностях. Инструмент PeptideMass использовали для вычисления массы полученных пептидов. Для прогнозирования потенциальной биологической активности пептидов применяли программный ресурс с открытым исходным кодом Peptide Ranker.

Результаты исследований и их обсуждение

Данная статья является продолжением исследований, направленных на изучение процесса ферментации животного белка методом in silico . Ранее авторами было изложено обоснование необходимости проведения вышеуказанных исследований и представлены экспериментальные данные по поиску и идентификации белка VIP_PIG (P01284) [15].

Для определения характеристик пептидов белка VIP_PIG (P01284) выбрали программное обеспечение PeptideCutter, прогнозирующее потенциальные места расщепления заданными протеазами или химическими веществами.

Из доступных ферментов и химических веществ выбрали все ферменты, предложенные программным обеспечением: протеиназа Arg-C, эндопептидаза Asp-N, Asp-N-эндопептидаза + N-концевой Glu, BNPS-скатоле, каспаза1-каспаза10, высокая специфичность химотрипсина (C-термин для [FYW], не перед P), низкая специфичность химотрипсина (C-термин [FYWML], не перед P), клострипаин, CNBr, энтерокиназа, гранзимеБ, фактор Xa, муравьиная кислота, глутамилэндопептидаза, гидроксиламин, йодособензойная кислота, ЛизК, ЛизН, NTCB (2-нитро-5-тиоцианобензойная кислота), пепсин (рН1.3), пепсин (рН>2), пролин-эндопептидаза, протеиназа K, стафилококковая пептидаза I, протеаза вируса травления табака, термолизин, тромбин, трипсин (табл. 1).

Таблица 1

Результаты расщепления белка P01284 доступными протеазами*

Название фермента	Количество расщеплений	Расположение мест расщепления
Протеиназа Arg-C	4	12 56 58 75
Эндопептидаза Asp-N	4	2 8 46 51
Asp-N-эндопептидаза + N-концевой Glu	5	2 8 23 46 51
CNBr	1	61
Высокая специфичность химотрипсина (С-термин для [FYW], не перед Р	6	6 10 22 50 54 66
Низкая специфичность химотрипсина (С-термин [FYWML], не перед Р	17	1 6 10 13 14 17 22 23 26 45 50 54 57 61 66 67 71
Клострипан	4	12 56 58 75
Муравьиная кислота	4	3 9 47 52
глутамилэндопептидаза	1	24
Гидроксиламин	1	72
ЛизК	6	20 21 59 64 65 74
ЛизН	6	19 20 58 63 64 73
Пепсин (pH 1.3)	14	5 6 9 10 13 16 17 25 26 49 50 57 70 71
Пепсин (pH>2)	18	5 6 9 10 13 16 17 21 25 26 49 50 53 54 57 65 70 71
Протеиназа К	27	2 5 6 7 10 13 14 17 19 22 23 24 26 27 48 49 50 51 54 55 57 62 63 66 67 70 71
Стафилококковая пептидаза I	1	24
Термолизин	19	1 4 5 12 13 16 18 22 25 26 48 49 56 60 61 62 66 69 70
Трипсин	10	12 20 21 56 58 59 64 65 74 75

*Информация получена из результатов поиска с помощью программного обеспечения PeptideCutter 15 ноября 2024 г.

Во время моделирования эксперимента некоторые выбранные протеазы ( BNPS-скатоле, каспаза1-каспаза10, энтерокиназа, фактор Xa, гранзимеБ, йодособензойная кислота, NTCB (2-нитро-5-тиоцианобензойная кислота), пролин-эндопептидаза, тромбин, протеаза вируса травления табака) не смогли оптимально расщепить и высвобождать биоактивные пептиды.

Тем не менее многие протеазы продемонстрировали высокий потенциал в генерации большого количества расщеплений белка. Количество расщепленных пептидных связей указывает на степень гидролиза белка.

Анализируя табличные данные, отмечаем, что наибольшее колличество мест расщеплений дают протеиназа К (27 расщеплений), термолизин (19 расщеплений) и пепсин рН>2 (18 ращеплений). Участки расщеплений с помощью исследуемых ферментов нанесены на карты последовательностей и представлены на рисунках 1–3.

ПротК|

ПротК ||

ПротК | ||

ПротК || ||

ПротК ||| ||

ПротК | ||| ||

ПротК | | ||| ||                  ПротК

ПротК | | | ||| ||                  ПротК |

ПротК || | | ||| ||                 ПротК| |

ПротК |  ||  | | ||| ||                 ПротК || |

ПротК| |  ||  | | ||| ||                 ПротК|  |||

ПротК|| |  ||  | | ||| ||                ПротК||  |||

ПротК ||| |  ||  | | ||| ||               ПротК||||| |

| ||| | || | | ||| || |||| || | HADGVFTSDFSRLLGQLSAKKYLESLIXXXXXXXXXXXXXXXXXHSDAVFTDNYTRLRKQ 1 ---------+ --------- +---------

+ --------- +---------+---------+ 60    ПротК

ПротК |

ПротК ||

ПротК| ||

ПротК || ||

ПротК | || ||

|| || ||

MAVKKYLNSILNGKR

61 --------- +----- 75

Рисунок 1 – Карта участков расщеплений белка P01284 ферментом протеиназа К

Терм

Терм |

Терм ||

Терм | ||

Терм Терм | | ||

Терм | Терм | | | ||           Терм Терм

Терм || Терм | | | | ||             Терм | Терм |

| || || | | | || || | | HADGVFTSDFSRLLGQLSAKKYLESLIXXXXXXXXXXXXXXXXXHSDAVFTDNYTRLRKQ 1 --------- +---------+ --------- +

• - --+ --------- + --------- + 60 Терм

Терм |

Терм ||

Терм | ||

Терм | | ||

|| | ||

MAVKKYLNSILNGKR

61 --------- +----- 75

Рисунок 2 – Карта участков расщеплений белка P01284 ферментом термолизин

Pn2

Pn2 |

Pn2 ||                        Pn2

Pn2 | ||                          Pn2 |

Pn2| | ||                           Pn2||

Pn2 || |  ||     Pn2                 Pn2 |||

Pn2 | || | || Pn2 Pn2 |                Pn2 | || |

|| || | || | || || || | HADGVFTSDFSRLLGQLSAKKYLESLIXXXXXXXXXXXXXXXXXHSDAVFTDNYTRLRKQ 1 ---------+---------++

• - --+---------+---------+ 60 Pn2

Pn2 Pn2 |

| ||

MAVKKYLNSILNGKR

61 --------- +----- 75

Рисунок 3 – Карта участков расщеплений белка P01284 ферментом пепсин (рН>2)

Далее с помощью программного обеспечения PeptideMass расщепляли белковую последовательность и вычисляли массу полученных пептидов.

При расчете масс учитывали:

• -    отобразить пептиды с массой: превышающей 500 и меньше, чем unlimited Далтон сортируется попептидным массам;

• -    для каждого отображаемого пептида показать : все известные посттрансляционные модификации;

• -    максимальное количество пропущенных сколов (MC): 0;

• -    модификации цистеинов: все цистеины в восстановленной форме с аддуктами акриламида (Cys_PAM);

• -    модификации метионинов: метионины не подвергались окислению;

• -    расчет массы: используя моноизотопные массы встречающихся аминокислотных остатков и определяя массу пептида как [M+H]⁺.

Результат моделирования гидролиза с использованием выбранных коммерческих ферментов представлен в таблице 2.

Молекулярная масса, положение, пептидная последовательность белка, высвобождаемые различными ферментами*

Таблица 2

Молекулярная масса			Положение			Пептидная последовательность
протеиназа K	пепсин (рН>2)	термоли зин	протеиназа K	пепсин (рН>2	термоли зин	протеиназа K	пепсин (рН>2)	термо лизин
469,1929	469,1929	859,3944	7–10	7–10	6–12	TSDF	TSDF	FTSDF SR
438,2711	438,2711	509,3082	20–22	20–22	19–22	KKY	KKY	AKKY
375,2350	437,2030	348,1765	11–13	3–6	23–25	SRL	DGVF	LES
348,1765	375,2350	317,1819	24–26	11–13	14–16	ESL	SRL	LGQ
317,1819	227,1138	262,1033	15–17	1–2	2–4	GQL	HA	ADG
290,1346	219,1339	219,1339	3–5	25–26	17–18	DGV	SL	LS
227,1138	204,0979	156,0767	1–2	15–16	1–1	HA	GQ	H
177,0870	177,0870	132,1019	18–19	18–19	13–13	SA	SA	L
166,0862	148,0604	132,1019	6–6	24–24	26–26	F	E	L
132,1019	132,1019	132,1019	14–14	14–14	27–27	L	L	I
132,1019	132,1019	118,0862	23–23	17–17	5–5	L	L	V
132,1019	132,1019	916,4159	27–27	23–23	50–56	I	L	FTDN YTR
633,3501	132,1019	544,3565	58–62	27–27	57–60	RKQMA	I	LRKQ
512,1987	537,3395	537,3395	51–54	63–66	63–66	TDNY	VKKY	VKKY
438,2711	512,1987	429,1728	64–66	51–54	45–48	VKKY	TDNY	HSDA
429,1728	446,2609	333,1768	45–48	68–71	67–69	HSDA	NSIL	LNS
389,2507	431,2725	246,1448	55–57	58–60	71–72	TRL	RKQ	LN
333,1768	429,1728	150,0583	68–70	45–48	61–61	NSI	HSDA	M
166,0862	389,2507	132,1019	50–50	55–57	70–70	F	TRL	I
133,0608	265,1546	118,0862	72–72	49–50	49–49	N	VF	V
132,1019	221,0954	90,0549	67–67	61–62	62–62	L	MA	A
132,1019	133,0608	–	71–71	72–72	–	L	N	–
118,0862	132,1019	–	49–49	67–67	–	V	L	–
118,0862	–	–	63–63	–	–	V	–	–

* Информация получена из результатов поиска с помощью программного обеспечения PeptideMass 06 декабря 2024 г.

Выявлено, что протеиназа К высвобождает большее количество предпочтительных биоактивных пептидов по сравнению с другими ферментами одноименного действия. Эффективность этих ферментов в высвобождении пептидов с биоактивностью зависит в основном от специфичности расщепления.

Наиболее длинный пептид «FTSDFSR» был обнаружен в образцах, подвергшихся обработкой термолизином, в то же время данный пептид обладал самой высокой молекулярной массой (859,3944 кДа). Пептид «VKKY» был признан наиболее часто встречающимся в образцах, обработанных всеми тремя ферментами, и был первым по массе (537,3395) при обработке пепсином (рН>2). Наименьшую массу (90,0549) показал пептид «A», обработанный термоли-зином.

Следующим этапом исследования предстояло изучение прогнозируемой биологической активности выбранных пептидов.

Идентифицированные пептиды различались по длине: от 1 до 7 аминокислот, и имели показатели Peptide Ranker в диапазоне от 0,1 до 0,99 (табл. 3).

Таблица 3

Идентифицированные пептидные последовательности из фракции гидролизата VIP белка с молекулярной массой 8,539 кДа

Пептидная последовательность и ранжировка пептидов по прогнозируемой биологической активности
протеиназа K		пепсин (рН>2)		термолизин
TSDF	0,3	TSDF	0,3	FTSDFSR	0,498556
KKY	0,105	KKY	0,105	AKKY	0,139303
SRL	0,49389	DGVF	0,729146	LES	0,0577883
ESL	0,0804803	SRL	0,49389	LGQ	0,322493
GQL	0,49668	HA	0,184157	ADG	0,309463
DGV	0,161525	SL	0,330018	LS	0,204782
HA	0,184157	GQ	0,376251	H	0,226978
SA	0,141393	SA	0,141393	L	0,639092
F	0,999052	E	0,0240725	L	0,639092
L	0,639092	L	0,639092	I	0,223609
L	0,639092	L	0,639092	V	0,0266109
I	0,223609	L	0,639092	FTDNYTR	0,283549
RKQMA	0,20774	I	0,223609	LRKQ	0,127531
TDNY	0,106237	VKKY	0,0655318	VKKY	0,0655318
KKY	0,105	TDNY	0,106237	HSDA	0,113
HSDA	0,113	NSIL	0,245434	LNS	0,125503
TRL	0,271255	RKQ	0,0987733	LN	0,257214
NSI	0,118644	HSDA	0,113	M	0,970074
F	0,999052	TRL	0,271255	I	0,223609
N	0,109656	VF	0,815398	V	0,0266109
L	0,639092	MA	0,693293	A	0,208643
L	0,639092	N	0,109656	–
V	0,0266109	L	0,639092	–
V	0,0266109	–		–

* Информация получена из результатов поиска с помощью программного обеспечения Peptide Ranker 12 декабря 2024 г.

Для каждого пептида было получено значение, указывающее на его потенциальную активность. В дальнейших исследованиях будут использованы только те пептиды, у которых показатель пептидного ранкера выше 0,5, так как чем ближе показатель к 1, тем выше биологическая активность пептида.

Таким образом, было идентифицировано 6 пептидных последовательностей, обладающих потенциальной биоактивностью.

В ходе исследования было установлено, что среди использованных ферментов пепсин (pH>2) теоретически продемонстрировал гидролиз большинства биологически активных пептидов, за ним следуют протеиназа К и термолизин.

Данные согласуются с исследованиями других авторов и объясняются тем, что пепсин обладает более широкой специфичностью и преимущественно расщепляет пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами и аминокислотами с карбоксильными группами.

Так, F.C.А. Panjaitan и др. признали пепсин (pH > 2) наиболее перспективным ферментом для получения биоактивных пептидов из белка гигантского морского окуня, идентифицированных с помощью протеомики, который теоретически высвобождает 82 ингибирующих DPP-IV пептида и 47 ингибирующих ACE-I пептидов [16].

Использование пепсина при гидролизе желатина привело к образованию пептидов, полученных из коллагена с низкой молекулярной массой от 3 до 6 кДа [17].

P. Kęska и др. в своей работе использовали пепсин для выделения из вяленой свиной корейки пептидов с молекулярной массой менее 7 кДа, способных ингибировать DPP-IV [18].

Доказано, что расщепление ферментами существенно влияет на процесс протеолиза. Его можно использовать для изменения степени гидролиза пептидов в зависимости от различных ферментов.

Поскольку Peptide Ranker прогнозирует, насколько вероятна биологическая активность пептидов, но не указывает, для каких целей они наиболее подходят, дальнейшие исследования будут направлены на определение токсичности, аллергенности, а также наличия терапевтического эффекта in silico и in vivo .

Заключение

Представленные в исследовании результаты подтверждают, что применение техники in silico может обеспечить быструю и надежную информацию об идентификации биоактивных пептидов из гидролизатов белков и определить выбор подходящего фермента для получения этих пептидов.

Результаты анализа гидролизата P01284 показали, что животные белки могут быть хорошими источниками пептидов. Более того, пепсин (pH>2) продемонстрировал наибольшую перспективность в высвобождении биоактивных пептидов из гидролизатов белков. Кроме того, свиные субпродукты могут быть альтернативным источником биоактивных пептидов, которые могут использоваться в качестве функционального ингредиента в фармацевтической и нутрицевтической продукции. Однако необходимо дальнейшее тестирование in vivo , чтобы гарантировать безопасность и стабильность этих пептидов во время желудочно-кишечного пищеварения.