Моделирование in vitro защитных иммунных механизмов при африканской чуме свиней

Свиньи, пережившие инфицирование вирулентным или аттенуированным штаммами вируса африканской чумы свиней (АЧС), как правило, не погибают от повторного заражения гомологичными по сероиммунотиповой принадлежности вирулентными изолятами или штаммами (1-3). Это свидетельствует о формировании вирусспецифической иммунной защиты. Однако до сих пор остаются дискуссионными вопросы о протективной значимости гуморальных и клеточных звеньев иммунитета при АЧС.

Несмотря на отсутствие при АЧС антивирусных нейтрализующих антител, имеются экспериментальные данные об антителозависимом компоненте устойчивости к вирусной инфекции (4). Сообщалось, что перенос сыворотки или молозива от выживших после переболевания АЧС животных интактным свиньям может задержать проявление клинических симптомов, уменьшить виремию и увеличить процент выживших особей после их заражения вирусом АЧС (1, 5, 6). In vitro продемонстрирован антителоопосредованный цитолиз зараженных вирусом АЧС моноцитов и макрофагов в реакциях комплемент-зависимого цитолиза (КЗЦ) и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) (7-9). С использованием различных методов, в том числе АЗКЦ, в сыворотке крови свиней обнаружены антитела к вирус-специфическим белкам уже на 3-7-е сут после инокуляции вируса АЧС. У выживших животных они определяются длительное время (9, 10). Экспериментально доказано важное значение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в формировании вирус-специфической защиты в ранние сроки после инфицирования вирусом АЧС (11, 12). Вместе с тем до их пор недостаточно изучен вклад АЗКЦ-, КЗЦ- и ЦТЛ-опосредованных механизмов в ограничение репродукции вируса АЧС, хотя исследования в этом направлении предпринимались (13).

Целью настоящей работы было определение значения клеточного и гуморального звеньев иммунитета в ограничении репродукции вируса африканской чумы свиней (АЧС) в модельных системах из культур лейкоцитов периферической крови интактного и иммунизированного аттенуированным штаммом вируса АЧС подсвинка на 6-е сут после прививки.

Методика . В работе использовали вирус АЧС из музея микроорганизмов Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии: вирулентные штаммы Ф-32 IV сероиммунотипа и К-73 II сероим-мунотипа, а также их аттенуированные производные (соответственно штаммы ФК-135 и КК-202) (14).

Продукцию интерлейкина-2 (IL-2) лимфоцитами периферической крови исследуемых свиней в ответ на стимуляцию конканавалином А измеряли по активности пролиферации IL-2 зависимой линии клеток Т-лимфоцитов мыши (CTLL-2), которую оценивали по включению ³Н-тимидина. Для этого у интактных и инокулированных вирусом АЧС подсвинков породы крупная белая массой 40-45 кг брали кровь из передней полой вены, смешивали с гепарином (20 ед/см³) и выделяли лимфоциты в градиенте плотности, используя фиколл-пак. Лимфоциты (3 млн/см³) культивировали в среде RPMI 1640 («Sigma-Aldrich», США) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (10 %), глутамина (1 мМ), 2-меркапто-этанола (2*10^-5 М) (среда культивирования) и 5 мкг/см³ конканавалина А в течение 48 ч при 37 ° С во влажной атмосфере (воздух + 5 % СО₂). По окончании суспензию клеток центрифугировали при 800 g 30 мин. Надосадок осветляли при 10 000 g 30 мин. Далее к 10⁴ клеток CTLL-2 в 0,1 см³ среды культивирования добавляли по 0,1 см³ полученных надосадков, в которых конканавалин А был блокирован добавлением 1 % (масса/объем) метил- а -П-маннопиранозида. Спустя 1 сут культивирования в смеси вносили ³Н-тимидин (по 1850 МБк) и через 6 ч измеряли включение радиоактивно меченного предшественника в клетки. Определение проводили в 6 повторностях и обрабатывали результаты статистически.

Для моделирования in vitro защитных иммунных механизмов при АЧС венозную кровь отбирали из передней полой вены подсвинка на 0 сут и через 6 сут после его иммунизации штаммом ФК-135 (10⁷ , ⁵ ГАЕ₅₀). Половину объема взятой венозной крови смешивали с гепарином (20 ед/см³) и оставляли на 1,5 ч при 37 ° С. Пипеткой отбирали белую кровь и осаждали при 800 g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 0,1 % гидролизате лактальбумина на солевом растворе Эрла с 5 % фетальной сыворотки теленка (среда культивирования), суспензию (5 млн кл/см³) разливали по 9 см³ в чашки Карреля и культивировали при 37 ° С. Из второй половины объема взятой венозной крови подсвинка получали сыворотку по общепринятой методике.

На 8-е сут после начала эксперимента неприкрепившиеся клетки в среде культивирования в каждой из чашек Карреля с культурой лейкоцитов крови отдельно сливали в стерильные центрифужные пробирки, а А-клетки заливали средой культивирования (5 см³). Неприкрепившиеся клетки из каждой чашки осаждали при 800 g в течение 20 мин. Полученные осадки ресуспендировали в 9 см³ среды культивирования и переносили в чашки Карреля с А-клетками по разработанной для эксперимента схеме, предварительно удалив из них помещенную ранее среду культивирования. Затем в чашки Карреля вносили по 1,0 см³ (10 %) сыворотки подсвинка, полученной на 0- или 6-е сут после иммунизации, по разработанной схеме. Во все чашки Карреля добавляли штамм Ф-32 (по 100 ГАЕ₅₀ в объеме 0,5 см³) и инкубировали при 37 ° С в течение 4 сут.

Накопление вируса АЧС определяли титрованием в культуре лейкоцитов свиней по гемадсорбции и выражали в ГАЕ50/см3.

Для статистической обработки полученных данных использовали стандартную компьютерную программу BIOSIS-1.

Результаты . Культуры лейкоцитов периферической крови свиней допустимо рассматривать как модели in vitro, в которых реализуются ви-рус-специфические иммунологические реакции, происходящие в течение анализируемого периода in vivo. Методологической основой работы послужила возможность смоделировать культуры лейкоцитов крови свиней в различных вариациях из трех компонентов: адгезированных на стекле клеток-мишеней (А-клетки, макрофаги), клеток-эффекторов (лимфоциты) в составе неприкрепившихся к стеклу клеток и сыворотки крови. Важно, что все исследования проводились в аутологичных системах при неизменной антигенпредставляющей способности А-клеток (9).

Для достижения поставленной цели важно было подобрать штамм-мы одной сероиммунотиповой группы, чтобы один из них был иммуногенным, другой — вирулентным. При этом иммуногенный штамм не должен обладать выраженными иммуносупрессивными свойствами. Поэтому на первом этапе работы оценивалось функциональное состояние лимфоцитов периферической крови в организме свиней, инокулированных различающимися по вирулентности и сероиммунотиповой принадлежности штаммами вируса АЧС. Для этого исследовали способность Т-лимфоцитов крови секретировать IL-2, который совместно с вирус-специфическими антигенами вызывает активацию и клональную экспансию антигенспе-цифических покоящихся цитотоксических Т-лимфоцитов.

1. Продукция IL-2 стимулированными конканавалином А лимфоцитами периферической крови от интактных, иммунизированных штаммами ФК-135 и КК-202, а также зараженных штаммами Ф-32 и К-73 подсвинков породы крупная белая

Двух подсвинков иммунизировали штаммом ФК-135 (10⁷ , ⁵ ГАЕ₅₀), двух других — штаммом КК-202 (10⁷ , ⁵ ГАЕ₅₀). Через 2 нед обоих подсвинков, иммунизированных штаммом ФК-135, и двух интактных заражали штаммом Ф-32 (10³ , ⁰ ГАЕ₅₀), а иммунизированных штаммом КК-202 и еще двух интактных — штаммом К-73 (10³ , ⁰ ГАЕ₅₀). На 6-е сут после каждой инокуляции определяли продукцию IL-2 стимулированными конканавалином А лимфоцитами периферической крови.

Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют, что иммунизация подсвинков штаммом ФК-135 и их последующее заражение штаммом Ф-32 не снижали функциональной активности Т-лимфоцитов. Заражение интактных подсвинков вирулентным штаммом Ф-32 приводило к супрессии Т-лимфоцитов, что проявлялось в уменьшении продукции IL-2 более чем в 2 раза. Инокуляция свиньям как аттенуированного штамма КК-202, так и вирулентного штамма К-73 вызывала достоверное снижение продукции IL-2 в 1,5-2,0 раза. В эксперимент по моделированию иммунных защитных механизмов in vitro были взяты штаммы IV сероиммунотиповой группы Ф-32 и ФК-135, поскольку последний не вызывает иммуносупрессии лимфоцитов свиней.

Эксперимент по моделированию защитных иммунных механизмов при АЧС in vitro на 6-е сут после иммунизации показал (табл. 2), что максимальное накопление вируса АЧС (7,50-7,67 lg ГАЕ50/см3) зарегистрировано в культуральных системах № 1 и № 5, в состав которых входили адгезированные клетки от интактного или иммунизированного подсвинка, а также неприкрепившиеся клетки белой крови и сыворотка от интактного животного.

2. Накопление вируса африканской чумы свиней (штамм Ф-32) в аутологичных культурах лейкоцитов периферической крови интактного (ИН) и иммунизированного (ИМ) штаммом ФК-135 подсвинка породы крупная белая, смоделированных в соответствии с разработанной для эксперимента схемой

Примечание. «+» и « - » — соответственно наличие и отсутствие компонента.

Замена в системе культивирования неприкрепившихся клеток от интактного подсвинка на неприкрепившиеся клетки от иммунизированного (№ 2 и № 6) приводила к достоверному снижению накопления вируса АЧС на 0,67-0,83 lg ГАЕ50/см3. Основным ограничивающим механизмом в указанной конфигурации могли быть ЦТЛ, поскольку сыворотку брали от интактного подсвинка и вирус-специфические антителозависимые механизмы защиты не действовали.

Когда в системе культивирования присутствовали А-клетки интактного или иммунизированного подсвинка и неприкрепившиеся клетки от интактного животного, а сыворотка — от иммунизированного (№ 3 и № 7), накопление вируса АЧС снижалось на 1,34-1,83 lg ГАЕ50/см3. В указанной конфигурации накопление вируса ограничивалось антителозависимыми механизмами противовирусной защиты.

И, наконец, если в системе культивирования присутствовали А-клетки интактного или иммунизированного подсвинка одновременно с сывороткой и неприкрепившимися клетками белой крови, полученными от иммунизированного животного, накопление вируса АЧС в культуральных системах № 4 и № 8 снижалось по сравнению с контрольной (№ 1 и № 5) на 2,00-2,50 lg ГАЕ50/см3. В этой конфигурации действовали одновременно оба звена иммунной системы — клеточные (ЦТЛ) и антителоопосредованные (АЗКЦ, КЗЦ).

Таким образом, на 6-е сут после иммунизации штаммом ФК-135 в смоделированных системах антителоопосредованные противоклеточные механизмы превосходили ЦТЛ-опосредованные по способности ограничивать репродукцию вируса африканской чумы свиней. Судя по полученным результатам, ЦТЛ- и антителоопосредованные противоклеточные механизмы защиты действуют интегрированно, что позволяет предположить их направленность против различных эпитопов.