Моделирование ишемически-реперфузионного повреждения печени и почек в эксперименте: отработка методики

Ощутимый дефицит качественных донорских органов по-прежнему остаётся одним из наиболее острых вызовов, особенно если речь идёт о донорах с расширенными критериями или об асистоличе-ских донорах. Решение этой проблемы возникает на стыке хирургического мастерства, продвинутых биомедицинских технологий и глубокого понимания механизмов ишемически-реперфузионного повреждения (ИРП) [1].

Практика внедрения инновационных методов, таких как экстракорпоральная мембранная оксигенация (ECMO), гипотермическая оксигенированная перфузия (HOPE) и различные формы метаболической поддержки (к примеру, с применением дихлорацетата натрия), уже доказала свою эффективность, демонстрируя впечатляющие результаты в уменьшении повреждения тканей органов. Многочисленные эксперименты, проведённые как в доклинических условиях (на крысах, кроликах, свиных моделях), так и в клинических условиях, указывают на способность подобных вмешательств не только улучшать биохимические параметры, но и усиливать антиоксидантную защиту, что находит выражение в благоприятных морфологических картинах исследуемых образцов [2]. Параллельно наблюдается расширение клинического опыта трансплантаций от доноров с расширенными критериями, который подтверждает оправданность и дальнейшую перспективность подобных технологий.

Значительный интерес представляет эффективность различных температурных режимов при машинной перфузии органов: от глубокого охлаждения до субнормотермии и нормотермии, позволяющих сохранить тонкую архитектонику тканей и продлить жизнеспособность трансплантата [3]. Ряд объективных биохимических, морфологических и функциональных маркеров, полученных в ходе исследований, указывает на то, что систематическое внедрение этих подходов способно не только расширить круг доступных доноров, но и повысить общую результативность трансплантации, сократив риск осложнений и послеоперационного отторжения.

Впервые о машинной перфузии органов или ее прототипе говорят исследования 18 века, проведенные Максом фон Фреем и Максом Грубером [4]. Они соорудили закрытую систему с оксигенатором для перфузии органов, которая состояла из венозного резервуара, оксигенатора и перистальтического насоса. Сердце сохранялось в ней в течение нескольких часов. Эти эксперименты показали возможность поддержания жизнедеятельности отдельных органов вне организма и дали толчок для дальнейшего развития в этом направлении. Уже Алексис Каррель с опорой на имеющиеся представления разработал аппарат для перфузии органов совмест- но с Чарльзом Линдбергом в 1935 году [3]. Этот аппарат в контролируемых условиях поддерживал пульсирующую циркуляцию стерильной жидкости через орган (рис. 1).

Сравнивая с нынешними машинами, едва ли можно найти общие черты, но именно изобретение Линдберга и Карреля дало основу всем современным методам аппаратной перфузии. В настоящее время машинная перфузия рассматривается как способ увеличения пула доноров путем вовлечения доноров с «расширенными критериями отбора», то есть выходящих за рамки стандартных требований: возраст старше 50–60 лет, длительный анамнез гипертонической болезни, наличие сахарного диабета и других хронических заболеваний [5,6]. Риск трансплантации от таких доноров рассматривается как повышенный, в связи с чем подключение к аппаратной перфузии взамен стандартной статической холодовой перфузии имеет ряд преимуществ. Помимо маргинальных доноров, машинная перфузия может применяться для длительной транспортировки, например, из других регионов, что также увеличит охват трансплантаций [7].

Рисунок 1. Аппарат для перфузии целых органов, разработанный Алексисом Каррелем, Чарльзом Линдбергом и Отто Хопфом (1935). Орган помещен в герметичную камеру из выдувного стекла Pyrex и подключен к системе стеклянных трубок, имитирующих кровообращение. Фото: Луи Шмидт и Джозеф Б. Хау-ленбек, 1935. Цифровая коллекция Университета Рокфеллера Figure 1. A device for perfusion of whole organs, developed by Alexis Carrel, Charles Lindbergh and Otto Hopf (1935). The organ is placed in a sealed Pyrex blown glass chamber and connected to a system of glass tubes that simulate blood circulation. Photo: Louis Schmidt and Joseph B. Haulenbeck, 1935. Rockefeller University Digital Collection

В России с недавнего времени обширно развивается и расширяется применение перфузионных технологий в трансплантации. Первым подобным опытом обладают коллективы ММНКЦ им. С.П. Боткина (Москва), НМИЦ трансплантологии и искусственных органов имени В.И. Шумакова. Российским производителем (ООО «Трансбиотек», Санкт-Петербург, Россия, ООО «Биософт-М», Москва) разработан отечественный перфузионный аппарат для экстракорпоральной оксигенации “ExStream”, зарегистрированный для перфузии донорских органов. Вместе с тем отработка экспериментальной модели для изучения всех аспектов перфузии остается не до конца решенной, но важной задачей [8].

Цель исследования

Данное исследование выполнено с целью обоснования и отработки методики экстракорпоральной ex-vivo перфузии трансплантата печени на животной модели при помощи аппарата перфузионного для экстракорпоральной оксигенации “Ex-Stream” по ТУ 32.50.21-002-75538036-2020 (держатель РУ ООО «Трансбиотек», Санкт-Петербург, Россия, производитель ООО «Биософт-М», Москва, Россия). Исследование проводилось на мужских особях свиней массой 15–30 кг (n = 5). Исследование выполнено в соответствии с правилами лабораторной практики в Российской Федерации: приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.; приказ МЗ РФ No 267 от 19.06.2003 г.; Закон «О защите животных от жестокого обращения» от 01.12.1999 г., на проведение данного исследования было получено разрешение Комитета по биомедицинской этике НИИ им. Н.В. Склифосовского № 4-22 от 12 апреля 2022 г.

Материалы и методы

В основу исследования включён анализ результатов гипотермической оксигенированной перфузии трансплантата печени в условиях вивария с использованием аппарата искусственного кровообращения. Исследование проводилось по следующему протоколу: у животного осуществлялось изъятие донорской печени с формированием временного вено-венозного обхода, производились фармакохолодовая консервация органа при помощи аппарата «Ex-Stream» и её последующая реплантация. Во время процедуры гипотермической перфузии ex vivo исследовались такие показатели как рН перфузата, а также данные электрохимического исследования при помощи потенциостата-гальваностата ИПС, предназначенного для электрохимических исследований жидкостных и твёрдотельных систем, исследовались биохимические параметры перфузата, крови лабораторного животного.

Процедура эксплантации донорской печени

Свинье (Sus scrofa domesticus) весом 15–30 кг вводили успокоительное с помощью инъекции пентобарбитала натрия в ягодичную мышцу (3 мг/кг), диазепама (0,4 мг/кг) и атропина (0,02 мг/кг). Животное укладывали на спину и фиксировали на операционном столе. Для обезболивания использовали внутривенную инъекцию суксаметония хлорида (1 мг/кг) с последующей эндотрахеальной интубацией. Для поддержания общей анестезии применяли севофлуран (2 %).

Перед разрезом свинье внутривенно вводили 25 000 единиц гепарина. Производили верхнюю срединную лапаротомию и рассекали связки, окружающие печень. Проводили диссекцию ворот печени с разделением общего желчного протока, собственной печёночной артерии (последнюю перевязывали), а также структур печёночно-двенадцатиперстной связки над поджелудочной железой. Воротную вену тупо выделяли до слияния селезеночной и верхней брыжеечной вен. Общую печёночную артерию выделяли проксимально, а левую желудочную артерию пересекали. Селезёнку и желудок смещали медиально. Селезёночную артерию пересекали, а чревный ствол и общую печёночную артерию полностью выделяли. Нижнюю полую вену выделяли в полости перикарда, после чего из заранее подготовленных кондуитов трупных вен человека (подвздошных) формировали вено-венозный шунт (by-pass), при помощи которого соединяли конец-в-бок над- и подпечёночный отделы нижней полой вены. После чего нижнюю полую вену пережимали под шунтом, отсекали.

Рисунок 2. Каво-кавальный шунт

Figure 2. Cavo-caval shunt

Проводили быструю деваскуляризацию печёночной артерии, воротной вены, надпечёночной и подпечёночной полой вены, быстрое извлечение печени, подключение устройства Ex-Stream и начало перфузии раствором Belzer MPS® UW Machine Perfusion Solution (США) через воротную вену.

Определение показателей перфузии для эксперимента

Физиологические значения потока и давления определяются по-разному для печёночной артерии и воротной вены. Чтобы воспроизвести значения для воротной вены, равные 900 мл/мин (пульсирующий поток) и 5–7 мм рт. ст. соответственно, используется перистальтический насос, работающий при напряжении 5 В. В воротной вене скорость потока составляет 600–1200 мл/мин, а давление — 4–8 мм рт. ст. Для достижения этих значений потребовалось использовать гидростатический напор, создаваемый в резервуаре, заполненном жидкостью, с выходным соплом. Закон Стивено (закон гидростатического давления) гласит, что гидростатическое давление (P) в жидкости прямо пропорционально плотности жидкости (ρ), ускорению свободного падения (g) и высоте столба жидкости (h). Формула выглядит следующим образом:

P = ρ × g × h, где P – гидростатическое давление (Па); ρ – плотность жидкости (кг/м³); g – ускорение свободного падения (м/с²); h – высота столба жидкости (м).

Для расчёта высоты водяного столба, необходимой для создания желаемого гидростатического напора в АИК для перфузии свиной печени, нужно выразить высоту (h) из формулы:

h = P / (ρ × g).

Допустим, мы хотим создать гидростатическое давление в воротной вене, равное 6 мм рт. ст. (среднее значение из диапазона 4–8 мм рт. ст.). Переведём миллиметры ртутного столба в паскали: 6 мм рт. ст. = 6 × 133,322 Па = 799,932 Па ≈ 800 Па.

Плотность перфузионного раствора примем равной плотности воды при 4 °C (температура гипотермической перфузии): ρ = 1000 кг/м³; ускорение свободного падения: g = 9,81 м/с²:

h = 800 / (1000 × 9,81) = 0,0815 м = 8,15 см.

Закон Бернулли описывает зависимость между скоростью жидкости, давлением и высотой в потоке жидкости. Для расчёта скорости жидкости на выходе из АИК в воротную вену печени можно использовать упрощенную форму уравнения Бернулли, пренебрегая изменением высоты и считая плотность жидкости постоянной:

P1 + (ρ × v1²) / 2 = P2 + (ρ × v2²) / 2, где P1 и P2 – давление в двух точках потока (Па); ρ – плотность жидкости (кг/м³); v1 и v2 – скорость жидкости в двух точках потока (м/с).

Давление в АИК (P1) равно 20 мм рт. ст. (2666,44 Па), давление в воротной вене (P2) равно 6 мм рт. ст. (799,93 Па), а скорость жидкости в АИК (v1) равна 0,1 м/с. Плотность перфузионного раствора примем равной плотности воды при 4 °C: ρ = 1000 кг/м³.

v ≈ 1,93 м/с.

Для расчёта потребления кислорода во время перфузии печени использовалась формула

VO 2 = (П O 2 Sat – В O 2 Sat) × Hgb × 1,34 × (АИК + PV) / 100, где VO 2 – потребление кислорода (мл/мин); П O 2 Sat – насыщение кислородом перфузата на входе (%); В O 2 Sat – насыщение кислородом перфузата на выходе (%); Hgb – концентрация гемоглобина в перфузате (г/дл); 1,34 – константа, представляющая количество кислорода (в мл), связываемое 1 граммом гемоглобина; АИК – кровоток по аппарату (мл/мин); PV – портальный венозный кровоток (мл/мин).

Принимая П O 2 Sat = 98 %, В O 2 Sat = 75 %, Hgb = 10 г/дл, АИК = 200 мл/мин, PV = 800 мл/мин, тогда VO 2 = 3082 мл/мин.

Периферическое сосудистое сопротивление являлось расчётным показателем, вычисляемым по формуле:

R = P/V, где R – сопротивление; Р – давление в мм рт. ст.; V – объёмная скорость перфузии в мл/мин, и отображало податливость сосудистого русла трансплантата печени, что являлось предиктором восстановления печёночной функции после имплантации. С учётом специфики кровоснабжения печени у свиней перфузию артерии не проводили, при выполнении эксперимента было решено лигировать последнюю.

Методика перфузии печени в эксперименте

Для процедуры гипотермической перфузии донорской печени ex vivo предварительно выполняли сборку экстракорпорального контура. Перфузионный контур состоял из роликового насоса, блока инвазивного измерения давления, термодатчика, ёмкости для трансплантата печени, оксигенатора (использован неонатальный оксигенатор Maquet), перфузионных магистралей и перфузионной канюли.

Схематичное изображение экстракорпорального контура представлено на рисунке 3.

Перфузионный контур заполняли 100 мл раствора Бельзера (UW) при температуре 4 °С и добавляли гепарин 1000 ЕД. После проведённой фармакохолодовой консервации в воротную вену устанавливали внутривенный катетер, выполняли деаэрацию и коннекцию перфузионной магистрали к катетеру. Процедура гипотермической перфузии донорской печени ex vivo проводилась с регуляцией по давлению с ранее описанными параметрами перфузии.

Длительность процедуры составляла 30 минут, и по окончании гипотермической перфузии выполнялась реплантация.

Рисунок 3. Контур перфузии печени в эксперименте

Figure 3. The contour of liver perfusion in the experiment

Рисунок 4. Подключенный контур перфузии печени в эксперименте с оксигенатором Maquet

Figure 4. Connected liver perfusion circuit in the experiment with the Maquet oxygenator

Рисунок 5. Методика реплантации и реперфузии в эксперименте Figure 5. Method of replantation and reperfusion in the experiment

Процедура моделирования реперфузии и ИРП

Трансплантат помещался в брюшную полость животного, формировался проксимальный кавокавальный анастомоз конец-в конец, а нижний конец воротной вены животного ушивался. Ранее сформированный каво-кавальный шунт функционировал до выведения животного из эксперимента. Далее формировали портальный анастомоз, выполняли реперфузию. Время наблюдения после реперфузии составило от 45 минут до 2 часов, после чего эксперимент прекращали.

Для оценки результатов эксперимента использовали следующие методики: биохимические анализы – оценка маркеров повреждения тканей (АСТ, АЛТ, ЛДГ, ГГТП), измерение уровня окислительного стресса (малоновый диальдегид, глутатион), опре- деление провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β); выполняли гистологические исследования (микроскопическое в окраске гематоксилин-эозин, трихром по Масону, ультрамикроскопическое – просвечивающая электронная микроскопия), анализ потребления кислорода и продукции углекислого газа, потенциометрическое исследование перфузата при помощи потенциостата-гальваностата ИПС, исследование активности ферментов (супероксид-дисмутаза, каталаза) в ткани печени.

Результаты

В таблице 1 представлены сводные параметры – вес органа, температура в перфузате, давления в контуре, потока и сосудистого сопротивления в момент машинной перфузии и времени проведения.

Таблица 1. Результаты отработки методики перфузии в эксперименте

Table 1. Results of testing the perfusion technique in the experiment

№ наблюдения	Вес, г	Поток, мл/мин	Давление, мм рт. ст.	Сопротивление	Температура, °С	рН	PСО 2	PaО 2	Лактат
1	1400	90	5	0,05	4–6	6,88	6	125	8
2	1200	100	6	0,06	6–8	6,86	8	186	3
3	1600	89	7	0,07	6–9	6,83	6	201	5
4	1000	86	8	0,09	4–6	6,8	6	205	23
5	1200	90	5	0,05	4–6	6,89	9	164	16

В серии из 5 наблюдений были получены следующие результаты. Маркеры повреждения тканей (АСТ, АЛТ, ЛДГ, ГГТП) показали постепенное увеличение их уровня в перфузате с течением времени ишемии. Средние значения АСТ и АЛТ возросли в 2–3 раза, ЛДГ – в 1,5–2 раза, а ГГТП – в 1,2–1,5 раза по сравнению с исходными значениями. Уровень малонового диальдегида, отражающий окислительный стресс, повысился в среднем на 30–40 % к концу эксперимента, в то время как уровень глутатиона снизился на 20–25 %. Концентрации провоспали-тельных цитокинов (TNF- α , IL-6, IL-1 β ) в перфузате увеличились в 2–4 раза по сравнению с базовыми значениями, указывая на развитие воспалительного ответа.Микроскопическое исследование в окраске гематоксилин-эозин выявило признаки ишемического повреждения гепатоцитов, такие как вакуолизация цитоплазмы, пикноз ядер и нарушение балочной структуры. Степень повреждения нарастала с увеличением времени ишемии. Окраска по Масону показала умеренное увеличение соединительной ткани в портальных трактах и перицентральных зонах, свидетельствующее о начальных фибротиче-ских изменениях. Ультрамикроскопическое исследование (просвечивающая электронная микроскопия) выявило набухание митохондрий, нарушение целостности их крист, расширение эндоплазматического ретикулума и образование аутофагосом в гепатоцитах. Потребление кислорода тканью печени постепенно снижалось в ходе эксперимента, достигая 60–70 % от исходного уровня к концу наблюдения. Продукция углекислого газа также уменьшалась, но в меньшей степени, составляя 75–85 % от базовых значений. Анализ перфузата с помощью потенциостата-гальваностата ИПС показал постепенное снижение окислительно-восстановительного потенциала, указывающее на нарастание гипоксии и истощение антиоксидантных резервов. Активность суперок-сиддисмутазы и каталазы, ключевых антиоксидантных ферментов снизилась на 30–40 % и 20–30 % соответственно по сравнению с исходными значениями, свидетельствуя об ослаблении антиоксидантной защиты.

Полученные результаты демонстрируют развитие ишемически-реперфузионного повреждения печени в ходе эксперимента, характеризующегося нарастанием маркеров повреждения тканей, окис- лительного стресса, воспалительного ответа, гистологическими изменениями, нарушением энергетического метаболизма и ослаблением антиоксидантной защиты. Эти данные создают основу для дальнейшего изучения механизмов повреждения и разработки терапевтических стратегий.

В ходе проведения исследования интраоперационная летальность отсутствовала, и все животные успешно перенесли хирургическое вмешательство. Удалось поддерживать жизнеспособность моделей в течение периода от 45 минут до полутора часов, что позволило получить образцы желчи и крови для дальнейших исследований, а также провести морфологическую оценку тканей. Первые результаты полученных исследований на ограниченной серии в 5 наблюдений позволили получить воспроизводимые результаты.

Обсуждение

Машинная перфузия является многообещающим направлением в трансплантации печени, открывающим новые возможности для сохранения жизнеспособности органов вне человеческого тела [8]. Эта технология, привлекавшая внимание выдающихся учёных, таких как нобелевский лауреат Алексис Каррель, более ста лет назад, сегодня является альтернативой традиционному статическому холодовому хранению трансплантатов [9]. В последние десятилетия были разработаны различные методы машинной перфузии (МП), включая гипотермическую, нормотермическую, субнормотермическую и гипотермическую оксигенированную перфузию [10]. Исследования на животных моделях (свиньи, крысы, собаки) и различных типах трансплантатов (после сердечной смерти и смерти мозга) необходимы для изучения механизмов защиты, безопасности и осуществимости этих методов, а также новых устройств для их реализации [11].

В исследовании И.Ю. Цымбалюка, А.М. Мануйлова и К.А. Попова рассматривается метаболическая коррекция ишемически-реперфузионного повреждения печени с использованием дихлорацетата натрия (ДХА) при сосудистой эксклюзии, что моделирует такие условия, как маневр Прингла [12]. Эксперимент, проведённый на 105 самцах крыс, показал, что введение ДХА существенно снижает уровень маркеров повреждения печени, таких как лак- татдегидрогеназа (ЛДГ), аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ), а также повышает активность антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза (КАТ). Эти данные поддерживают идею о том, что метаболические вмешательства, такие как использование ДХА, могут значительно улучшить результаты трансплантации печени, минимизируя повреждения при ишемическом стрессе.

В статье О.Н. Резника, А.Е. Скворцова и В.С. Дайнеко [13] рассмотрены результаты трёхлетнего опыта трансплантации печени и почек от доноров, умерших вследствие внегоспитальной остановки сердца (OHCД), с использованием экстракорпоральной мембранной оксигенации (ECMO) для восстановления кровообращения и поддержания жизни органов потенциальных доноров. В период с 2017 по 2020 гг. в Санкт-Петербурге было проведено 67 случаев экстренной госпитализации пациентов с OHCД, из которых 4 случая реанимированы с помощью ECMO, что позволило восстановить кровообращение, а 11 доноров стали источником трансплантатов. В результате этого исследования были выполнены 22 трансплантации почки и 5 трансплантаций печени. Важными аспектами исследования являются точность и своевременность оценки состояния органов с помощью технологий, таких как КТ-анализ перфузии органов.

Работа А.В. Шабунина, М.Г. Мининой и П.В. Дроздова [14] фокусируется на применении машинной гипотермической оксигенированной перфузии (HOPE) для сохранения почечных трансплантатов от доноров с расширенными критериями. В исследовании, проведённом в Боткинской больнице с 2018 по 2021 гг., было выполнено 200 трансплантаций почки от посмертных доноров, включая 102 доноров с расширенными критериями. Использование HOPE в группе пациентов привело к снижению частоты отсроченной функции трансплантатов до 10 % по сравнению с 35,8 % в группе с традиционной холодовой консервацией. Эти данные подтверждают, что использование HOPE для сохранения почек от доноров с расширенными критериями является не только безопасным, но и эффективным методом для минимизации отсроченной функции трансплантатов.

В исследовании А.В. Шабунина, О.Б. Лорана и Д.Ю. Пушкаря [15] рассмотрена HOPE при трансплантации печени от доноров с расширенными критериями. Результаты показали, что применение HOPE значительно улучшает исходы трансплантации печени, снижая уровень ишемически- реперфузионного повреждения и улучшая восстановление функции печени. В группе с HOPE было зафиксировано статистически значимое снижение уровней АСТ и АЛТ в первую неделю после трансплантации, а также меньшее количество послеоперационных осложнений и короткий период нахождения реципиентов в интенсивной терапии. Морфологические исследования показали меньший уровень повреждения гепатоцитов по сравнению с традиционной холодовой консервацией.

В работе В.Г. Шестаковой, В.К. Богданова и Р.Д. Павлова [16] рассмотрено использование HOPE для почечных трансплантатов от асистолических доноров с применением раствора на основе декстрана-40. В эксперименте использовалась модель кролика, в которой доноры подвергались 30-минутной асистолии, после чего почки подвергались гипотермической перфузии с использованием раствора на основе декстрана-40. Результаты показали, что HOPE эффективно снижает периферическое сосудистое сопротивление, улучшает биохимические показатели, такие как уровень креатинина и мочевины, и способствует стабилизации этих показателей до физиологических значений к 12-му дню после трансплантации.

В работе M. Magbagbeola, Z.L. Rai, K. Doyle [17] описана низкозатратная система для гипотермической машинной перфузии печени с использованием свиных моделей. Эксперимент продемонстрировал успешную перфузию печени с использованием модульной системы, которая включает камеру для органа, насосы, кислородатор и датчики для мониторинга. Система показала долговечность и стабильные результаты при поддержании нормотермических условий для печени в течение 3 часов.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная модель с использованием аппарата Ex-Stream является воспроизводимой и позволяет эффективно изучать состояние ишемически-реперфузионного повреждения [18]. Это открывает возможности для проведения более масштабной и всесторонней серии экспериментов, результаты которой станут предметом наших дальнейших исследований. Успешное завершение данного этапа работы закладывает прочную основу для углубленного изучения механизмов ишемически-реперфузионного повреждения и разработки новых терапевтических стратегий, направленных на минимизацию повреждений трансплантируемых органов и улучшение результатов трансплантации [19].