Модельная биологическая система желточных липопротеидов: параметры инициированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы

Введение. Эндогенную интоксикацию рассматривают как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме (Копытова и др., 2009). Среди широкого круга метаболитов, обладающих способностью оказывать токсическое действие, особое место занимает пул веществ средней молекулярной массы, динамика которого отражает тяжесть эндогенной интоксикаци (Карякина, Белова, 2004; Алабовский и др., 2005; Копытова, 2006; Панченкова, Жичкина, 2011; Келина и др., 2012; Безручко и др., 2013; Кондратюк, Радченко, 2013). Молекулярная масса этих соединений колеблется в диапазоне 300-5000 дальтон (Д), в связи с чем их часто называют молекулами средней массы или среднемолекулярными пептидами (Логинов, 2009; Панченкова, Жичкина, 2011). Молекулы средней массы чаще всего играют роль неспецифических маркеров интоксикации, повышая свой уровень в крови (Скопичев, Жичкина, 2010; Шитов, 2013).

Развитие процессов интоксикации проявляется стереотипными реакциями организма на воздействие токсиканта, приводящими к активации процессов свободно-радикального окисления и окислительной модификации белков плазмы крови. Считается, что нарушение структуры белков, вызванное их окислительной модификацией при активации свободно-радикальных процессов, - один из неспецифических механизмов развития интоксикации (Малахова,

2000; Dalle-Donne rt al., 2003; Копытова и др., 2009; Dietrich-Muszalska, Olas, 2009; Обухова, 2010; Стеновая и др., 2010; Фомина и др., 2011; Разнатовская, 2012; Халдун и др., 2012; Garcia-Garcia et al., 2012).

Перспективным оказывается комплексное исследование молекул средней массы (МСМ) и окислительной модификации белков (ОМБ) в мониторинге (Рубцов и др., 2013а, б), для чего необходимы разработка и апробирование на различных модельных биологических системах метода оценки ОМБ в пуле МСМ. Этот метод может представлять значительный интерес, как для клинической биохимии, так и для других разделов биохимии и смежных с ней научных дисциплин.

Ранее было проведено обоснование оптимальных вариантов комплексного применения модельных биологических систем для оценки окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы, одним из которых является модельная биологическая система желточных липопротеидов с добавлением маточного молочка, а также с добавлением сыворотки крови крыс (Рубцов, 2013).

Цель работы - изучить параметры инициированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов.

Методика. Для оценки изучаемых тестов была проведена серия наблюдений на желточных липопротеидах с введением различных веществ, которые могли бы реагировать на изменение уровня свободнорадикальных процессов, в том числе в условиях металл-катализируемого окисления.

Желточные липопротеиды получали по методике Клебанова с соавторами (1988).

Выделены следующие серии наблюдений для изучения индуцированной (в присутствии ионов Ре2+) ОМБ в пуле МСМ: 1) желточные липопротеиды с добавлением препаратов с антиоксидантными свойствами (продукты пчеловодства в виде 30 % водных растворов - прополис, гомогенат трутневого расплода, мед, маточное молочко); 2) желточные липопротеиды с добавлением продуктов пчеловодства указанной концентрации и сыворотки крови крыс (самки и самцы). В каждой серии наблюдений эксперименты проводили в 7 повторениях.

Согласно Клебанову с соавторами (1988), введение в систему ионов Ре2+ сопровождается ускорением процессов свободнорадикального окисления, уровень аутоокисления плазмы крови и суспензии желточных липопротеидов крайне мал, причем плазма крови, 2+ по сравнению с желточными липопротеидами, в присутствии ионов Р е окисляется намного меньше. Клебанов с соавторами (1988) предположили, что в самом общем случае ингибирование плазмой крови пероксидации липидов желточных липопротеидов в присутствии ионов Ре2+ обусловлено наличием в плазме крови антиоксидантов и '                    -31 -

(или) веществ, обеспечивающих окисление и связывание ионов Fe2+.

Однако ранее не изучалась окислительная модификация белков в пуле молекул средней массы на модельной биологической системе желточных липопротеидов, как спонтанная, так и инициированная.

Серии проведенных нами наблюдений для изучения спонтанной ОМБ в пуле МСМ были аналогичны сериям наблюдений в случае инициированного окисления.

Изучение уровней ОМБ в пуле МСМ в нашей работе проводили на основе разработанного «Способа определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы» (Рубцов и др., 2012).

Для измерений экстинкций (в единицах оптической плотности) МСМ (при 254 нм) и ОМБ (при 356 нм, 370 нм, 430 нм, 530 нм) использовался спектрофотометр СФ-2000 (лаборатория кафедры биохимии Пензенского государственного университета). Согласно данным литературы, при 356 нм регистрируются алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 370 нм -алифатические кетондинитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 430 и 530 - алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны и кетондинитрофенилгидразоны основного характера (Дубинина и др., 1995; Лобанов и др., 2010).

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента (MS Excel).

Результаты и обсуждение. Анализ уровней МСМ и ОМБ в модельных биологических системах (МБС) с добавлением желточных липопротеидов при Ье -индуцированном окислении выявил две основные тенденции. При добавлении желточных липопротеидов к прополису и гомогенату трутневого расплода величины МСМ были выше, чем в исходных продуктах пчеловодства, а при добавлении меда и сыворотки крови крыс (как самок, так и самцов) проявилась обратная тенденция (рис. 1). Например, в меде уровень МСМ, по сравнению с желточными липопротеидами с добавлением меда, был больше в 1,4 раза (р<0,05).

Уровни ОМБ в желточных липопротеидах с добавлением продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс (как самок, так и самцов) при Ее2+-индуцированном окислении, как и при спонтанном окислении, проявили общую тенденцию снижения величин при переходе от 356 нм к 530 нм. Сопоставление их уровней ОМБ, по сравнению с добавляемыми продуктами пчеловодства и сывороткой крови крыс (как самок, так и самцов), показало наиболее ярко выраженные отличительные особенности при 530 нм (рис. 2).

расплода

Рис. 1 . Уровни МСМ в пробах без желточных липопротеидов (ЖЛП) и с ЖЛП при Ре2 -индуцированном окислении:

О - р<0,05 по отношению к пробам без ЖЛП

расплода

Рис. 2 . Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в пробах без желточных липопротеидов (ЖЛП) и с ЖЛП при Ре2+-индуцированном окислении: О- р<0,05 по отношению к пробам без ЖЛП

Установлено, что уровень ОМБ в пуле МСМ при 530 нм при добавлении к желточным липопротеидам указанных препаратов повышался во всех случаях, кроме прополиса и маточного молочка. При добавлении прополиса и маточного молочка к желточным липопротеидам имело место уменьшение значений в 1,3 раза (р<0,05).

Анализ уровней ОМБ в желточных липопротеидах с добавлением сыворотки крови крыс, по сравнению с желточными липопротеидами с добавлением продуктов пчеловодства, а также продуктов пчеловодства и сыворотки крови крыс, как и в предыдущей серии наблюдений, а также при спонтанном окислении, показал наиболее ярко выраженные отличительные особенности при 530 нм (рис. 3).

Рис. 3 . Уровни ОМБ, регистрируемые при 530 нм, в пробах с желточными липопротеидами (ЖЛП) и с ЖЛП сывороткой крови крыс и при Ре2+- индуцированном окислении:

О - р<0,05 по отношению к пробам только с ЖЛП

В случае желточных липопротеидов с добавлением прополиса величины ОМБ были выше при добавлении сыворотки крови самок и самцов крыс в 1,3 раза ив 1,2 раза, соответственно, а в случае маточного молочка - в 1,4 раза и в 1,6 раза, соответственно (р<0,05).

Заключение. Представляется перспективным использование рассматриваемой модельной биологической системы для изучения Fe2-индуцированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы. Одним из эффективных вариантов такого использования могут служить желточные липопротеиды с добавлением прополиса и маточного молочка, а также сыворотки крови крыс. Установлены характерные отличия изученной модельной биологической системы по уровню ОМБ, наиболее ярко выраженные при регистрации на 530 нм, что может служить параметрами, описывающими их реакционную способность, в том числе в условиях Ре2+-индуцированного окисления.

Авторы выражают признательность коллективу кафедры биохимии естественно-научного факультета Педагогического института им. ВТ. Пензенского государственного университета за поддержку и практические советы при проведении исследований.

Рубцов Г.К. Модельная биологическая система желточных липопротеидов: параметры инициированной окислительной модификации белков в пуле молекул средней массы / Г.К. Рубцов, Н.В. Безручко // Вести. ТвГУ. Сер. Биология и экология. 2014. № 2. С. 30-37.                 '