Модификация метода искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза в лабораторных условиях для определения колонизирующей активности штаммов-продуцентов микробиопрепаратов

Введение. Одной из серьёзных причин, препятствующих получению стабильно высоких урожаев подсолнечника – основной масличной культуры нашей страны, является ущерб, наносимый болезнями. Все большую вредоносность и распространенность на подсолнечнике в России приобретает фомоз, или черная пятнистость, Phoma macdonaldii (Sacc.) Boerema, сумчатая стадия Plenodomus lindquistii (Frezzi) Gruyter, Aveskamp & Verkley [1; 2; 3].

Решение проблемы защиты подсолнечника от болезней, в том числе и от фомоза, связано с разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающих в том числе приемы и методы биологической защиты.

Лаборатория биометода ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК – одна из немногих в России, которая занимается разработкой микробиологических средств защиты растений от болезней.

В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от болезней лежит ступенчатый скрининг выделенных штаммов антагонистов фитопатогенов к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней. Скрининг включает первичную оценку антагонистической активности штаммов in vitro, определение биологической эффективности лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе отобранных штаммов на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях in vitro, во влажной камере и в грунте. Активные штаммы оценивают на фитотоксичность к защищаемой культуре и ростостимулирующую активность. Наработанные лабораторные образцы микробиопрепаратов испытывают в мелкоделяночных опытах и производст- венных условиях [4].

С целью разработки микробиологического метода снижения вредоносности фо-моза подсолнечника нами проведен первичный скрининг грибных и бактериальных штаммов антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю болезни [5; 6].

На первом этапе вторичного скрининга штаммов антагонистов, выделенных в первичном скрининге, важно определить не только проявление ими антифунгаль-ной активности in vitro , но и обеспечение защитного и колонизирующего действия для семян и проростков на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях.

Колонизирующая активность – сложный процесс, показывающий возможность колонизации антагонистами ризосферы растения. Это определяется способностью антагонистов к прикреплению (адгезии) к поверхности корней, к хемотаксису в направлении корневых экссудатов, обладать устойчивостью к ряду ферментов и токсических соединений, выделяемых растениями [7].

Поэтому дальнейшим этапом нашей работы было модифицировать метод искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза в лабораторных условиях для определения колонизирующей активности штаммов-продуцентов микробиопрепаратов.

Материалы и методы. Для определения колонизирующей активности штаммов мы использовали методические рекомендации по оценке и отбору растений подсолнечника на устойчивость к фу-зариозной корневой гнили (Антонова, Саукова, 2005) [8], так называемый метод «перфорированных чашек Петри». Для этого двухдневные проростки подсолнечника сорта Р-453, полученные при проращивании семян в рулонах, размещали в отверстия перфорированной крышки чашки Петри так, чтобы кончики корней касались колонии патогенного изолята фомоза (рис. 1). В контрольном варианте кончики корней подсолнечника погружали в стерильную воду. Время выдержки проростков на колонии патогена определяли опытным путем (3 и 5 ч). Затем инфицированные проростки выдерживали в условиях влажной камеры в течение 3 суток. Температура в продолжение всего опыта 25 ºС. Повторность в опыте трехкратная.

а                     б

Рисунок 1 – Метод «перфорированных чашек Петри» (ориг.):

а – размещение двухдневных проростков подсолнечника в отверстия перфорированной крышки чашки Петри;

б – выдерживание зараженных проростков во влажной камере в чашке Петри

Оценку степени поражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза проводили согласно разработанной нами шкале.

Результаты и обсуждение. Формирование ризосферной микрофлоры происходит, как правило, уже в течение первых трех дней прорастания семян, а ее продвижение в более глубокие слои почвы связано с тем, что она следует за растущим корнем, выделяющим питательные вещества, одновременно стимулируя выделение экзаметаболитов растений [9]. Поэтому эффективность штамма-продуцента во многом определяется не только его способностью обеспечить защиту семян, но и колонизировать растущий корень.

Нами модифицирован метод искусственного заражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза в лабораторных условиях для определения колонизирующей активности штаммов-продуцентов микробиопрепаратов.

Для учета степени поражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза нами разработана пятибалльная шкала (рис. 2):

0 баллов – здоровые проростки;

• 1    балл – потемнение кончика корня, интенсивное развитие боковых корней;

• 2    балла – потемнение корня на треть или до середины, но интенсивное развитие боковых корней;

• 3    балла – перетяжка гнили посередине корня или между гипокотилем и корнем, но интенсивное развитие боковых корней;

• 4    балла – загнивание корня до середины или перетяжка между гипокотилем и корнем, боковые корни развиты слабо;

• 5    баллов – полное загнивание корня, боковые корни развиты слабо или отсутствуют;

• 1 –3 – жизнеспособные проростки;

• 4 –5 – нежизнеспособные проростки.

0 баллов      1 балл    2 балла

3 балла      4 балла 5 баллов

Рисунок 2 – Шкала оценки степени поражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза при использовании метода «перфорированных чашек Петри» (ориг.)

Определен оптимальный срок выдержки кончиков корней проростков подсол- нечника на колонии патогена. Испытывали срок выдержки 3 и 5 ч. Учет проводили в течение 3 суток, ежесуточно (таблица).

Таблица

Степень поражения главного корня проростков подсолнечника возбудителем фомоза в зависимости от срока выдержки кончиков корней на колонии патогена г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Срок выдержки кончиков корней на колонии патогена, ч	Поражено проростков, %
	степень поражения главного корня, баллы
	через, суток	0	1	2	3	4	5	итого
3	1	80,0	10,0	30,0	20,0	0	0	60,0
	2	40,0	10,0	30,0	30,0	0	0	70,0
	3	10,0	10,0	0	70,0	10,0	0	90,0
5	1	30,0	20,0	20,0	30,0	0	0	70,0
	2	10,0	20,0	10,0	50,0	10,0	0	90,0
	3	10,0	20,0	10,0	50,0	0	10,0	90,0
Контроль без инфекции	1	95,0	5,0	0	0	0	0	5,0*
	2	93,0	7,0	0	0	0	0	7,0*
	3	90,0	7,0	3,0	0	0	0	10,0*

* Поражение проростков подсолнечника возбудителями сухой гнили и бактериоза

При сроке выдержки кончиков корней проростков подсолнечника на колонии патогена 3 ч уже через сутки после заражения общий процент пораженных возбудителем фомоза корней составил 60,0 %, со степенью поражения главного корня 1, 2 и 3 баллом – 10,0; 30,0 и 20,0 % соответственно. Через двое суток поражение проростков патогеном составило 70,0 %, со степенью поражения 1, 2 и 3 баллом – 10,0; 30,0 и 30,0 % соответственно. Через трое суток поражение проростков возросло до 90,0 %, со степенью поражения 1, 3 и 4 баллом – 10,0; 70,0 и 10,0 % соответственно.

При сроке выдержки кончиков корней проростков подсолнечника на колонии патогена 5 ч уже в первые сутки после заражения отмечен высокий процент пораженных проростков (70,0 %). Степень поражения 1, 2 и 3 баллом составила 20,0; 20,0 и 30,0 % соответственно. Через двое и трое суток поражение проростков достигло 90,0 %, с одинаковой степенью поражения 1, 2 и 3 баллом – 20,0; 10,0 и

50,0 % соответственно, с добавлением по 10,0 % на вторые сутки – с 4 баллом и на третьи – с 5 баллом.

Таким образом, срок выдержки кончиков корней проростков подсолнечника на колонии патогена 3 ч создает уже в первые сутки средний фон заражения патогеном (60,0 %), при котором возможно оценить разницу между вариантами по колонизирующей активности лабораторных образцов микробиопрепаратов на раннем этапе. Тогда как при слишком жестком фоне, который создается при сроке выдержки корней проростков 5 ч (в первые сутки – 70,0 %, а во вторые – уже 90,0 %), разницы между вариантами можно не увидеть.

Выводы. 1. Для определения колонизирующей активности лабораторных образцов микробиопрепаратов методом «перфорированных чашек Петри» учеты рекомендуем проводить по разработанной нами пятибалльной шкале оценки степени поражения проростков подсолнечника возбудителем фомоза.

• 2 . Оптимальный срок выдержки кончиков корней проростков подсолнечника на колонии патогена 3 ч создает уже в первые сутки средний фон заражения патогеном (60,0 %), при котором возможно оценить разницу между вариантами по колонизирующей активности лабораторных образцов микробиопрепаратов на раннем этапе.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и администрации Краснодарского края р_ Наставник № 19-416-235003.