Модификация параметров жизнеспособности иммуноцитов у детей, ассоциированная с сочетанным воздействием химических техногенных и экстремальных климатических факторов

Аликина Инга Николаевна – младший научный сотрудник лаборатории методов клеточной диагностики отдела иммунобиологических методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Долгих Олег Владимирович – доктор медицинских наук, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики (e-mail: ; тел.: 8 (342) 236-39-30; ORCID: .

Состояние здоровья населения отражает условия его жизни, состояние иммунной защиты и степень адаптированности к неблагоприятным условиям окружающей среды. Климатические условия на Крайнем Севере дискомфортны для человека, социальные условия жизни во многом уступают таковым в центральных и южных регионах страны. На севере Сибири расположены крупные промышленные комплексы, формирующие загрязнение среды обитания населения и угрозы негативного воздействия на здоровье жителей, в частности детского населения как контингента, наиболее чувствительного к изменениям окружающей среды [1–4]. В научной литературе имеется ряд данных, указывающих на изменение как уровня, так и структуры заболеваемости различных групп детей, проживающих в условиях техногенного неблагополучия [5, 6]. В среде обитания человека существует огромное разнообразие химических соединений, представляющих собой гаптены. Канцерогенные вещества обладают способностью взаимодействовать друг с другом, активизироваться в благоприятных химических условиях, трансформироваться и / или длительное время сохраняться в любой органической и неорганической среде [5, 7]. Ароматические и полиароматиче-ские углеводороды занимают особое место среди токсичных веществ, загрязняющих атмосферу. Они содержатся в выбросах двигателей автотранспорта, промышленных предприятий, больших и малых систем отопления. Среди канцерогенов высокой распространенностью в условиях российского Севера обладает бенз(а)пирен. Один из путей поступления бенз(а)пирена в организм – ингаляционный. Вещество является химически и термически устойчивым, обладает свойствами биоаккумуляции, свойства канцерогена проявляет при концентрации более 0,1 мкг/100 м³. Помимо канцерогенного бенз(а)пирен оказывает мутагенное, эмбриотокси-ческое, гематотоксическое действия [6].

В условиях Севера сочетанное воздействие климатических и экзогенных средовых факторов негативно влияет на организм человека, вызывает развитие тяжелых стрессовых реакций, создает дополнительные трудности для растущего организма. Совокупность факторов оказывает существенное влияние на иммунную систему детского организма, приводя к развитию дезадаптационных реакций, снижению резервных возможностей и росту заболеваемости. Иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим факторам окружающей среды. В условиях высокой загрязненности атмосферного воздуха изменения здоровья чаще реализуются в виде вторичных иммунодефицитных состояний, способствующих распространенности сенсибилизации [8–10].

Особую актуальность представляет изучение состояния здоровья населения на промышленно развитых территориях Крайнего Севера России с выде- лением особенностей маркеров эффекта, характеризующих ранние нарушения иммунологического здоровья детского населения в климатических условиях Заполярья.

Целью исследования является изучение ранних изменений индикаторных показателей иммунологического профиля (маркеры апоптоза) детского населения, проживающего в условиях комбинированного воздействия негативных химических техногенных и климатических факторов Крайнего Севера.

Материалы и методы. Обследованы 75 детей, проживающих на территории интенсивного промышленного освоения Крайнего Севера (Красноярский край) и посещающих детские образовательные учреждения. Приоритетным химическим экзогенным фактором в данном регионе является бенз(а)пирен, а ведущим климатическим – экстремально низкая температура воздуха в зимнее время года (средняя температура в зимний период –33,8 °С). Группу сравнения составили дети ( n = 35), проживающие и посещающие детские образовательные учреждения на территории Заполярья, условия которой характеризуются отсутствием воздействия техногенных химических факторов.

Исследование иммунного статуса включало анализ общего количества лейкоцитов, относительного и абсолютного количества лимфоцитов с использованием стандартизированных общеклинических методов анализа на гематологическом анализаторе Drew-3 (D3) DrewScientific (Великобритания, США). В периферической крови детского населения были изучены мембранные и транскрипционные показатели клеточной гибели лимфоцитов, а также уровень специфических антител IgG к бенз(а)пирену.

Исследование включало определение количества следующих субпопуляций лимфоцитов: активированные T-лимфоциты CD3⁺CD95⁺, CD3⁺HLA-DR⁺. Уровень клеточной гибели лимфоцитов определяли окрашиванием Аннексином V-FITC ( Annexin V-FITC , США) и одновременно витальным красителем про-пидиум йодид ( Propidium Iodium , PI , США), что позволяет идентифицировать клетки на ранней стадии апоптоза. Для оценки системы программируемой клеточной гибели исследовали внутриклеточную экспрессию белка – Bax, внутриклеточный маркер апоптоза – р53-протеин и поверхностную экспрессию рецептора к фактору некроза опухоли альфа 1-го типа (TNFR1 – tumor necrosis factor receptor). Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в градиентном растворе фикола – урографина. Плотность градиента для фракционирования форменных элементов крови человека равна 1,077 г/см³. Выбор данных показателей основывался на гипотезе модификации комбинированной нагрузкой (экстремальность климатических температурных условий и контаминация экзогенными химическими гаптенами) процесса программируемой клеточной гибели в условиях сочетанного влияния факторов риска.

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили с использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur (США). К суспензии лимфоцитов добавляли меченые флуорохромом моноклональные антитела (МАТ) к определенному маркеру лимфоцитов, в дальнейшем они связывались с лимфоцитами, которые экспрессируют маркер, соответствующий данному моноклональному антителу. Отмывали суспензии клеток путем центрифугирования, используя раствор CellWash (BD, США), тем самым избавляясь от не связавшихся с клетками антител.

Идентификация IgG специфического к бенз(а)-пирену осуществлялась с использованием конъюгированных с пероксидазой реагинов методом аллергосорбентного тестирования, где аллерген сорбирован на целлюлозных подложках. Фотометрическое измерение оптической плотности проводили на имму-ноферментном анализаторе Sunrise (Tecan, Austria).

Результаты были оценены с помощью универсальной программы анализа данных Statistica, Statsoft, Inc. (США). Значимость различий оценивалась с помощью t -критерия Стьюдента. Различия между группами считали достоверным при р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. По результатам фенотипирования иммуноцитов в группе наблюдения установлена гиперэкспрессия абсолютного и относительного уровней лимфоцитов активационных фенотипов – активированных Т-киллеров CD3⁺HLA-DR⁺, CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов (относительное значение), рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (TNFR1), а также внутриклеточного протеина, индуцирующего апоптоз p53. Нарушения относительно референтных уровней выявлены соответственно у 15,34; 12,1; 47,9 и 18,8 % детей.

У детей группы наблюдения установлена активация уровня клеток, окрашенных Annexin V, в 1,4 раза выше соответствующих данных группы сравнения (p < 0,05). Клетки, окрашенные витальным красителем PI, значительно превышают по количеству фенотипы, окрашенные Annexin V, а также аналогичные показатели группы сравнения (в 1,5 раза). Это связано с тем, что клетки в условиях стресса быстрее достигают поздней стадии клеточной гибели или уже погибли (некроз). На поздних стадиях апоптоза клетки теряют целостность клеточной мембраны и поглощают витальный краситель [11, 12]. Однако данный показатель не выходил за пределы референтного уровня (таблица).

По результатам исследования отмечается повышение уровня экспрессии HLA-DR+ на лимфоцитах по отношению к группе сравнения на 12,4–13,7 %. Уровень экспрессии маркера поздней активации HLA-DR+ отражает выраженность иммунного ответа. Избыточность экспрессии Т-лимфоцитов может наблюдаться при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением (аутоиммунные заболевания, гепатит C, пневмония и др.) [12, 13]. Установлен повышенный – в 1,3 и 1,4 раза (относительное и абсолютное значения соответственно) – уровень рецептора апоптоза иммуноцитов CD95+. Данный маркер экспрессируется на всех клетках иммунной системы и играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы (жизненного цикла иммуно-цитов). Повышение числа лимфоцитов, презентирующих CD95+, является закономерным проявлением активации иммунной системы, что характерно для иммуновоспалительного процесса [14–16]. Также в крови детей группы наблюдения отмечено достоверное увеличение содержания рецептора к фактору некроза опухоли (TNFR) и клеточного опухолевого антигена p53 в 1,5 и 1,2 раза соответственно. Отмечено, что существенных различий с референтным уровнем проапоптического белка bax выявлено не было, но наблюдалось значительное увеличение этого показателя – в 1,3 раза – по отношению к группе сравнения. Известно, что холодовое

Показатели иммунологического профиля исследуемых групп детей

П р и м е ч а н и е : * – статистически достоверное различие с референтным уровнем по непарному критерию Стьюдента при р < 0,05; ** – статистически достоверное различие с группой сравнения по непарному критерию Стьюдента при р < 0,05.

воздействие вызывает большие сдвиги, выражающиеся в изменении количества белков, перераспределении их фракций и увеличении продуктов белкового обмена [17].

Установлена достоверная разница между группами по содержанию антител к бенз(а)пирену – продукция специфического IgG у детей группы наблюдения превышала аналогичные значения в группе сравнения в 2,4 раза ( р < 0,05). При попадании в организм полициклические углеводороды под действием ферментов образуют эпоксисоединение, реагирующее с гуанином, что препятствует синтезу ДНК, вызывает нарушение или приводит к возникновению мутаций, способствующих развитию раковых заболеваний, в том числе таких видов рака, как карциномы и саркомы [16]. Стресс-зависимый белок p53 в ответ на повреждение ДНК тормозит смену фаз клеточного цикла, тем самым индуцируя апоптоз клетки [18–20]. В нашем исследовании уровень экспрессии фосфопротеина p53, как и рецептора туморнекротического фактора TNFR, выходит за верхнюю границу, характерную для нормальных значений, в пробах крови детского населения группы наблюдения, достоверно превышая соответствующие показатели группы сравнения. Таким образом, можно сделать вывод, что экстремальные климатические условия и избыточность экзогенного гаптена бенз(а)пирена (о чем свидетельствует гиперэкспрессия специфического IgG) в совокупности выступают симуляторами апоптоза, способствуя избыточности данных белков, ускоряющих гибель иммуноцитов у детского населения промышленного сибирского Заполярья.

В результате проведенной оценки относительного риска ( RR )¹ развития нарушений событий апоптоза в условиях избыточной контаминации бенз(а)пиреном установлено, что в крови исследуемого детского контингента наблюдается повышенный риск избыточной экспрессии как мембранных факторов клеточной гибели: TNFR ( RR = 12,17), CD3⁺СD95⁺ ( RR = 5,42), HLA^-DR⁺ ( RR = 4,80), являющихся аффекторами апоптоза, так и внутриклеточных транскрипционных факторов, модулирующих апоптогенные сигналы: bax ( RR = 4,55) и p53 ( RR = 3,71). При этом отсутствует риск поломки эффекторных структур апоптотиче-ского сценария, сцепленных с Annexin V .

Таким образом, для исследуемого детского контингента, проживающего на территории Крайнего Севера, аддитивный эффект экстремальных климатических условий в сочетании с экзогенной гаптенной стимуляцией приводит к дисбалансу иммунного статуса, который выражается гиперэкспрессией показателей клеточной гибели: повышением уровня транскрипционных факторов онкосупрессии: bax и p53, а также мембранных факторов: TNFR, CD3+HLA-DR+, CD3+СD95+, отвечающих за пусковой и транскрипционный этапы сценария апоптоза.

Необходимо отметить, что данное исследование представляет собой анализ особенностей модификации программированной клеточной гибели у детского контингента в условиях сочетанного воздействия природных (экстремальных холодовых) и техногенных (экзогенных химических) негативных факторов на процессы апоптоза, результаты которого позволяют прогнозировать риски возникновения ранних нарушений здоровья.

Выводы. Особенности параметров жизнеспособности иммуноцитов у детского контингента в условиях сочетанного воздействия техногенных и экстремальных климатических факторов характеризуются гиперпродукцией специфического IgG к бенз(а)пирену, а также избыточной экспрессией показателей клеточной гибели: факторов транскрипции и онкосупрессии bax и р53; мембранных фенотипов, ответственных за реализацию апоптоза CD3⁺HLA-DR⁺, CD3⁺СD95⁺, TNFR как на стадии его запуска, так и на стадии внутриклеточной модуляции его программы, которая подвергается негативной модификации условиями гаптенного окружения (бенз(а)пирен), что определяет иммунодефицитное состояние иммунного профиля детей в данных условиях. Проведенная оценка относительного риска ( RR ) развития нарушений событий апоптоза в условиях избыточной контаминации бенз(а)пиреном показала, что при повышении концентрации бенз(а)-пирена в крови исследуемого детского контингента установлен повышенный риск избыточной экспрессии как мембранных факторов клеточной гибели: TNFR ( RR = 12,17), CD3⁺СD95⁺ ( RR = 5,42), HLA^-DR⁺ ( RR = 4,80), являющихся аффекторами апоптоза, так и внутриклеточных транскрипционных факторов, модулирующих апоптогенные сигналы: bax ( RR = 4,55) и p53 ( RR = 3,71).

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.