Молекулярная экология как основа современной методологической базы оценки состояния окружающей среды

природопользования являются: сохранение окружающей природной среды и обеспечение ее защиты; ликвидация экологических последствий хозяйственной деятельности в условиях возрастающей экономической активности и глобальных изменений климата» [12]. Таким образом, одним из важнейших направлений деятельности научного сообщества и актуальной проблемой природопользования является определение методологической базы, позволяющей корректно и эффективно оценивать состав и состояние многокомпонентных биотических систем в условиях постоянного усиления антропогенного давления. Кроме того, требуемая методология должна обеспечивать возможность определения реакции исследуемой системы на изменения различных параметров среды в условиях лабораторного эксперимента. Экстраполяция полученных данных о функциональном ответе системы позволит с достаточной достоверностью прогнозировать развитие реальной ситуации, своевременно разработать и принять превентивные меры с целью сохранения биологического разнообразия и обеспечения самовосстановления экосистемы в целом.

Ранее мы представили результаты апробации современных подходов к экологическому мониторингу для оценки возможного социального ущерба от изменения состояния водоемов [5]. В качестве ключевых индикаторных групп рассматривали сообщества микроорганизмов и рыбное население.

Цель настоящей работы: обоснование возможности и необходимости расширения области применения молекулярно-генетических методов для решения экологических задач.

В качестве ключевых индикаторных групп, как для наземных, так и для водных экосистем, мы предлагаем использовать сообщества микроорганизмов (в том числе симбиотическую и ассоциированную с многоклеточными организмами микрофлору). Экосистемный подход к оценке состояния среды дает возможность ранней диагностики ее изменений. Сигналом тревоги служит разбалансировка продукционно-деструкционных процессов, протекающих в основном благодаря сообществам микроорганизмов, одним из наиболее существенных компонентов живого населения планеты. С одной стороны, они играют важнейшую роль в процессах круговорота веществ и энергии в трофической цепи организмов, с другой – именно они (и симбиотические, и свободноживущие) мгновенно реагируют на любые изменения условий среды обитания [7, 17, 19]. Кроме того, именно специфические сообщества микроорганизмов и вирусов зачастую становятся одним из лимитирующих факторов при освоении новых территорий (природно-очаговые инфекции вирусного и бактериального генеза) [1].

Трудно переоценить потенциал молекулярно-биологических методов при изучении состава многокомпонентных биотических систем «хозяин-симбионты первого порядка – симбионты второго порядка», включая «хозяин-вирус» in situ и их функционального статуса при изменении окружающей среды по экспрессии соответствующих генов. Существует масса ярких примеров эффективного использования возможностей молекулярной экологии: определение экологических характеристик взаимоотношений организмов-экстремофилов, обитающих на морском дне в районах «черных курильщиков»; характеристика метаболизма ряда монофагов (в частности, термитов), обеспечиваемого многоступенчатой системой симбионтов; использование растениями и животными вирусов эндосимбионтов в качестве защитных агентов [14, 16, 18, 22].

Молекулярно-экологические исследования вируса клещевого энцефалита . Клещевой энцефалит (КЭ) – одна из самых распространенных и опасных природно-очаговых инфекций лесной зоны Eвразийского континента [4]. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) вызывает заболевание, характеризующееся лихорадкой, интоксикацией и поражением центральной нервной системы [15]. Основными переносчиками ВКЭ являются клещи рода Ixodes , широко распространенные в умеренной зоне смешанных хвойно-широколиственных лесов Северного полушария [1]. Описаны 3 субтипа вируса: дальневосточный, европейский и сибирский. ВКЭ дальневосточного субтипа вызывает наиболее тяжелые формы заболевания с летальностью до 20-35%, а наименее вирулентным является вирус европейского субтипа с летальными исходами в единичных случаях. Однако принадлежность к определенному субтипу не позволяет прогнозировать тяжесть заболевания, т. к. во многих исследованиях было показано, что все субтипы ВКЭ могут вызвать полный спектр клинических проявлений инфекции [6, 9]. Таким образом, своевременная и специфичная диагностика КЭ in situ имеет огромное значение в профилактике и лечении этого заболевания [10]. При этом классические вирусологические методы достаточно трудоемки и длительны по времени выполнения, что затрудняет их применение для эпидемиологического мониторинга территорий. В современной практике успешно применяются методы ДНК-диагностики, специфичность которых достигает 100%, а чувствительность – 75-98%. Они позволяют детектировать генетический материал ВКЭ в исследуемых образцах при его самых низких концентрациях в течение нескольких часов [11]. Нами проведен молекулярно-генетический анализ коллекции штаммов ВКЭ дальневосточного субтипа с различными клиническими проявлениями (проф. Г.Н. Леонова, НИИЭМ СО РАМН, г. Владивосток).

Разработана схема и адаптированы условия амплификации, определены полногеномные нуклеотидные последовательности. Сравнительный анализ выявил мутации, коррелирующие со степенью вирулентности. Полученные данные позволяют создать диагностический набор для детекции высокопатогенных вариантов вируса in situ , что представляется нам важным для корректной оценки потенциальной опасности природного очага [2]. Аналогичный подход может быть использован при разработке методологий мониторинга других вирусных инфекций человека и животных.

Молекулярные исследования сообществ микроорганизмов из различных мест обитания: генетическое разнообразие и функциональный статус. Современный арсенал методов молекулярной экологии позволяет определять реальный состав сообществ микроорганизмов методами амплификации и секвенирования фрагментов генов 16S (для прокариот) или 18S (для эукариот) рРНК. Изучение генетического разнообразия без культивирования значительно расширяет возможности исследователей, а внедрение технологии ПЦР в реальном времени помогает охарактеризовать структуру сообщества и оценить его функциональный статус. Последние данные по изучению микробных сообществ показали, что в природных экосистемах практически отсутствуют индивидуальные бактериальные клетки: микроорганизмы образуют ассоциации друг с другом; с органическими и неорганическими частицами; с эукариотическими организмами, – для повышения своих собственных ресурсов выживания. Идентификация и определение физиологического статуса «некультивируемых» бактерий является актуальной проблемой, учитывая, что многие патогенные штаммы способны длительное время сохраняться в лабораторных условиях в особом, «спящем» физиологическом состоянии. Разнообразие и физиологический статус отдельных групп микроорганизмов в природных экосистемах представляет несомненный интерес для исследователей, изучающих экологические проблемы водной микробиологии. В работе разработаны и использованы следующие методические подходы: для выявления доминирующих и некультивируемых гетеротрофных бактерий – культивирование на питательных средах и эксперимент по фильтрации-акклиматизации, соответственно; для характеристики разнообразия и оценки физиологического статуса микробных сообществ in situ – молекулярно-генетический анализ тотальной ДНК и селективное ингибирование внеклеточной ДНК; для характеристики структуры микробных сообществ – амплификация в режиме реального времени с групп-специфичными праймерами на целевые группы микроорганизмов. Полученные результаты позволяют определить спектр индикаторных групп микроорганизмов разного таксономического уровня для проведения экологического мониторинга пресных вод.

Кишечная микрофлора представляет собой еще одну многокомпонентную биотическую систему, исследование которой в настоящее время развивается в нескольких направлениях: установление качественного и количественного состава сообществ микроорганизмов и определение функциональной значимости их компонентов. Изучение генетического разнообразия кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса Thymallus baicalensis выявило невысокое разнообразие генотипов, среди которых отмечены представители как облигатных аэробных, так и анаэробных бактерий. Нами получены новые генотипы Mycoplasma и некультиви-руемых бактерий филогенетической группы Спирохеты, разработаны методы их количественной оценки в кишечниках рыб [3].

Молекулярные исследования сообществ микроорганизмов: состав и реакция на изменения среды. Одним из несомненных преимуществ молекулярно-экологического подхода является возможность в экспериментально контролируемых условиях исследовать влияние изменений параметров среды на состав и структуру сообществ микроорганизмов in vitro. В отличие от высших организмов, негативные последствия у которых зачастую проявляются по прошествии значительного времени, бактерии и протисты на такие изменения реагируют практически моментально. Так, одним из наиболее распространенных в настоящее время последствий антропогенного влияния является эвтрофикация водоемов. Мы провели серию экспериментов, имитирующих этот процесс в лабораторных условиях, с примморфами байкальской губки Lubomirskia baicalensis. Губки (Porifera) являются симбиотическими организмами, однако роль симбионтов в функционировании и эволюции губок до сих пор не ясна [20]. Поскольку установить характер взаимодействий симбионтов в естественных условиях практически невозможно, в лабораторной практике используют культуру клеток губок (примморфы). Агрегационная способность диссоциированных клеток губок была установлена ещё в классических опытах Wilson (1907) [21]. Примморфы по сути являются промежуточным звеном между единичной клеткой и сформировавшейся губкой и могут служить удобной моделью для решения многих проблем физиологии, клеточной и молекулярной биологии [13]. Отработаны условия получения долгоживущей истощенной культуры примморф L. baicalensis, молекулярногенетическая идентификация эндосимбионтов с использованием универсальных рибосомных праймеров позволила установить генетическую близость эукариот с группой хлорококковых водорослей Pseudodictyosphaerium/Mychonastes, прокариоты представлены родами Bacillus, Micrococcus и Pseudomonas. При эвтрофикации среды (добавлении пептона) состав сообщества остался прежним, но его структура изменилась: зарегистрировано уменьшение количества копий фрагментов генов 18S рРНК (эукариот) и значительное увеличение 16S рРНК (прокариот), с последующей диссоциацией и гибелью прим-морф. Аналогичные результаты были получены при повышении температуры культивирования. Показан лимитирующий характер этих параметров среды для байкальских губок и их симбиотических ассоциаций.

Выводы: молекулярная экология действительно может стать одной из основ методологической базы, позволяющей не только эффективно определить состав и оценить состояние многокомпонентных биотических систем, но и контролировать реакцию исследуемой системы на изменения различных параметров среды в условиях in vitro . К явным достоинствам этой методологии можно отнести высокую технологичность, обеспечивающую стандартизацию методик и возможность формализованной обработки результатов.

Работа выполнена при поддержке интеграционного проекта СО РАН №122, программы РАН №26, подпрограммы 1, проекта 26.13, ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. ГК № 389П и гранта РФФИ №09-04-00977.