Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса прагриппа-3

Респираторные заболевания являются важной проблемой в молочном скотоводстве, которая в основном затрагивает молодое поголовье. Болезни органов дыхания крупного рогатого скота носят многофакторный и многоэтиологический характер, в котором, наряду с вирусами и бактериями, задействованы факторы риска, связанные с окружающей средой.

Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота является одним из основных возбудителей респираторных болезней, особенно у молодняка [1, 3, 9]. Это РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Paramyxoviridae и поражающий центральную нервную и дыхательную системы, способствующий повреждению тканей у телят [2, 6]. Течение парагриппа-3 также может осложняться вторичной бактериальной инфекцией и приводить к тяжелой бронхопневмонии.

На основе филогенетического и генетического анализа зарубежными исследователями было выявлено три генотипа вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота: A (BPIV3a), B (BPIV3b) и C (BPIV3c) [12]. Генотип А был впервые был выделен в США, а также был обнаружен в Японии, Китае, Аргентине и Египте [5, 10]. До 2012 года генотип В, был зарегистрирован только в Австралии, согласно Maidana и др., в 2012 году генотип

В был также выделен в Аргентине [7]. Генотип С был обнаружен в Южной Корее, Китае, Японии, Турции и Аргентине [4, 8, 10, 11]. Несмотря на то, что вирус был выделен в России еще в 1968 году, информация о генотипическом разнообразии этого инфекционного агента, циркулирующего на территории РФ, в частности, в Республике Татарстан отсутствует.

Целью данного исследования было выявление и молекулярная характеристика штамма парагриппа крупного рогатого скота типа 3 (BPIV-3), полученного из образцов легких и мазков из носа крупного рогатого скота в Лаишевском районе Республики Татарстан, а также вакцинного штамма ПTK 45/86.

Материал и методы исследований. В работе использовали следующие штаммы: 1. SF-4 – референтный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) – 7,25 lg ТЦД 50/мл, гемагглютинирующий титр 1:32 в РГА с 1 % эритроцитами морской свинки. Этот штамм был использован для контроля; 2. ПТК-45/86 – вакцинный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК – 6,75 lg ТЦД 50/мл, гемагглютинирующий титр 1:16 в РГА с 1 % эритроцитами морской свинки (ЭМС).

Данный штамм был использован в исследовании в качестве контроля и для сравнения с референтным штаммом; 3. ЛД-9 - вирусный изолят, выделен из патологического материала от больного респираторным заболеванием теленка из Лаишевского района РТ (на основании изучения физико-химических и биологических свойств идентифицирован как вирус ПГ-3), инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК – 6,25 lg ТЦД 50/мл.

Выделение нуклеиновой кислоты (РНК) вируса проводили из образцов тканей (носовая слизь, легочная ткань и лимфатические узлы) с использованием коммерческого набора РИБО-преп (AmpliSens, Россия), согласно инструкции производителя. Все выделенные пробы перед тестированием хранили при температуре минус 20 ° C.

Вирусная РНК подвергалась обратной транскрипции с помощью комплекта REVERТA-L (AmpliSens, Россия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Образцы ДНК изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПТК-45/86 и референтного штамма SF-4 были исследованы методом ПЦР со специфическими праймерами, кодирующими фрагмент матричного гена (М гена) вируса. В таблице 1 указаны область и размеры ампликона. Амплификацию проводили в твердотельном амплификаторе фирмы «Терцик» ДНК-технология (Россия).

Таблица 1 – Область и размеры ампликона

Вирус	Ген	Праймер	Нуклеотидные последовательности праймеров	Размер продукта
ВПГ-3	М-ген	M 1	AGTGATCTAGATGATGATCCA	328 п.н.
		M 2	GTTATTGATCCAATTGCTGT

Таблица 2 – Нуклеотидные последовательности штаммов вируса ПГ-3 крупного рогатого скота из GenBank, использованные для филогенетического анализа

Вирус	Номер в GenBank	Страна	Генотип	Длина генома
SF-4	AF178655	USA	a	15456
NM09	JQ063064	China	a	15456
JCU	EF108221	Australia	a	697
BN-1	AB770484	Japan	a	15480
ISU	EU439428	USA	a	15480
Texas	EU439429	USA	a	15456
910N	D84095	JAPAN	a	15480
Kansas	AF178654	USA	a	15454
LE017	MG976794	Uruguay	a	274
BP4158	EF108222	Australia	b	697
TVMDL15	KJ647284	USA	b	15474
SD0835	HQ530153	China	c	15498
NX49	KT071671	China	c	15474
TVMDL20	KJ647287	USA	c	15474
HS9	LD000638	Japan	c	15474
12Q061	JX969001	Korea	c	15474
GP	AB012132	Japan	/	15462

По 10 мкл полученных продуктов ПЦР были внесены в лунки 1,5 % агарозного геля, электрофорез проходил при 200 В в течение 40 мин. Детекцию результатов        проводили        на трансиллюминаторе с длиной волны 312

нм.

Продукты

амплификации

подвергались секвенированию.

Секвенирование проводили в

Междисциплинарном центре протеомных исследований Казанского федерального университета (КФУ) методом Сэнгера на секвенаторе NextSeq 500 (Illumina) с использованием тех же самых праймеров ПЦР и режима амплификации.

Результаты секвенирования были проанализированы с помощью программ UGENE и MegAlign Pro. Частичные геномные последовательности полевого изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПТК-45/86 и референтного штамма SF-4 были выравнены с последовательностями штаммов вируса парагриппа-3, полученными из базы данных GenBank с использованием программы ClustalW системы MegAlign Pro (DNASTAR) (Таблица 2). Построение филогенетического древа также осуществлялось с применением системы MegAlign Pro.

Результат исследований. В результате полимеразной цепной реакции из всех трех образцов были получены специфичные продукты амплификации размером 328 п.н.

Специфический фрагмент матричного гена (М-гена) был визуализирован с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Электрофорез продуктов амплификации: М – маркер молекулярных масс; 1, 2, 3 – положительные результаты амплификации фрагмента М гена штаммов SF-4, ПТК-45/86 и

ЛД-9 вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

В результате множественного выравнивания 17 нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank, с последовательностями, полученными нами, российский изолят ЛД-9 показал 98,3 % идентичность с референтным штаммом SF-4, относящимся к генотипу А, тогда как российский вакцинный штамм ПТК 45/86 был на 100 % идентичен референтному штамму SF-4 (Таблица 3). Нуклеотидная последовательность фрагмента М-гена изолята ЛД-9 вируса ПГ-3 была размещена в базе данных GenBank под регистрационным номером MW524841.

Результаты филогенетического анализа показали, что российский изолят ЛД-9 (MW52481) и вакцинный штамм ПTK45/86 относятся к генотипу А вируса парагриппа-3, как и референтный штамм SF-4 (Рисунок 2).

Таблица 3 – Сравнительный анализ идентичности в нуклеотидных последовательностях области М гена (328 п.н.) изолята ЛД-9, вакцинного штамма ПTK45/86 и 17 штаммов вируса

ПГ-3 крупного рогатого скота

Штаммы	Идентичность, %
	SF-4	ПТК45/86	ЛД-9
ПТК45/86	100	/	98,25
ЛД-9	98,3	98,25	/
SF-4	/	100	98,3
NM09	94,3	94,3	92,98
JCU	92,5	92,5	90,8
BN-1	93,42	93,42	91,67
ISU*	91,67	91,67	89,91
910N	93,42	93,42	91,67
Kаnsas*	99,12	99,12	97,35
BP4158	87,28	87,28	85,53
Texas	100	100	98,25
TVMDL15	86,84	86,84	85,09
SD0835	87,72	87,72	86,4
NX49	87,72	87,72	84,4
TVMDL20	87,28	87,28	85,96
HS9	88,16	88,16	86,84
12Q061	87,28	87,28	85,96
LE017	99,12	99,12	97,37
GP**	81,58	81,58	81,4

Примечание: *swine parainfluenza virus type 3 (SPIV-3), **Human parainfluenza type 3 (HPIV-3)

Рисунок 2 – Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов вируса ПГ-3 на основе фрагмента М гена

Заключение. Матричный белок вируса парагриппа-3 играет важную роль в сборке     вирионов,     установлении персистирующей инфекции и патогенезе вируса. Ген (М-ген), кодирующий этот белок, является подходящей мишенью для создания информативной филогенетической реконструкции вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности фрагмента М-гена представителей BPIV-3 показал, что российский изолят ЛД-9 и вакцинный штамм ПTK-45/86 относятся к генотипу А. Вакцинный штамм ПTK-45/86, в свою очередь, присутствует в живой вакцине «Тривак», применяемой для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи крупного рогатого скота. Выделенный изолят ЛД-9 генотипически близок к американским и уругвайским штаммам.

Вакцины, используемые в России против вируса парагриппа крупного рогатого скота-3, были разработаны на основе референтного штамма, принадлежащего генотипу А. Перекрестная защита таких вакцин от парагриппа-3, вызванного генотипами В и С, остается неясной, поэтому следует оценить необходимость разработки альтернативных диагностических тестов и вакцин для профилактики. Генетическая характеристика циркулирующих штаммов возбудителя может способствовать разработке более эффективных методов диагностики и профилактики данной инфекции.

В данном исследовании сообщается о молекулярно-генетической характеристике полевого штамма вируса ПГ-3 крупного рогатого скота, выделенного в Республике Татарстан. Фрагменты М-гена российского изолята ЛД-9 и вакцинного штамма ПТК-45/86 были секвенированы и выравнены с соответствующими последовательностями штаммов вируса, представленными в GenBank. Результаты филогенетического анализа показали, что российский изолят ЛД-9 (MW52481) и вакцинный штамм ПTK45/86 относятся к генотипу А вируса парагриппа-3, как и референтный штамм SF-4. Российский изолят ЛД-9 показал 98,3 % сходство с референтным штаммом SF-4, а российский вакцинный штамм ПТК-45/86 был идентичен референтному штамму на 100 %.

Summarу

This study reports on the molecular-genetic characterization of a field strain of BPIV-3 isolated in the Republic of Tatarstan. M gene fragments of the Russian isolate LD-9 and the vaccine strain PTK/86 were sequenced and aligned with the corresponding sequences of the virus strains presented in GenBank. The results of the phylogenetic analysis showed that the Russian isolate LD-9 (MW52481) and the vaccine strain PTK45/86 belong to the genotype A of the parainfluenza virus-3, as well as the reference strain SF-4. The Russian isolate LD-9 showed 98.3 % similarity with the reference strain SF-4, and the Russian vaccine strain PTK-45/86 was 100 % identical to the reference strain.