Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редкого вида растений Пермского края Adenophora lilifolia (L.) А. DC

В настоящее время весьма актуальна проблема выбора объектов для сохранения популяционных генофондов редких видов растений, которая может быть решена с использованием молекулярных маркеров и технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации. К числу редких декоративных, имеющих лекарственное значение, видов растений Урала относится Adenophora lilifolia (L.) А. DC. – бубенчик лилиелистный из семейства Cam-panulaceae Juss. Вид внесен с категорией 3 (R, редкий вид) в Красную книгу Пермского края [2008]. Является реликтом [Камелин, Овеснов, Шилова, 1999]. A. lilifolia в Пермском крае находится на границе ареала. В связи с хозяйственным освоением территорий общая численность ценопопуляций A. lilifolia на территории Пермского края за последние 10 лет в среднем сократилась на 15–20% [Красная книга …, 2008].

Цель работы – провести молекулярно-генетическую идентификацию и паспортизацию четырех ценопопуляций A. lilifolia в Пермском крае и провести отбор ценопопуляций для сохранения генофонда этого вида.

Материалы и методы

Первая ценопопуляция (Ad1) расположена в травяном сосняке на территории историко- природного памятника (г. Подкаменная) в Кунгурском районе Пермского края, вторая ценопопуляция (Ad2) – в березовом редколесье в 2 км на север от с. Енапаево Октябрьского района, третья (Ad3) – в смешанном лесу в 2,5 км на северо-запад от с. Усть-Турка Кунгурского района, а четвертая (Ad4) – на территории парка «Кузьминка» пос. Ильинский Ильинского р-на, являющегося историкоприродным комплексом. Наименьшее географическое расстояние между изученными ценопопуля-циями – 63 км, а наибольшее – 174 км.

Для анализа генетического полиморфизма ДНК A. lilifolia были собраны листья с 35 случайно выбранных особей в каждой популяции на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Выделение ДНК проводили по методике A.M. Torres, N.F. Weeden, A. Martin [1993]. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 720 проб ДНК посредством полимеразной цепной реакции [Молекулярная генетика, 2007] с использованием ISSR-метода (Inter Simple Sequence Repeats) [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994] и IRAP-метода ( I nter- R etrotransposon A mplified P olymorphism) [Kalendar et al., 1999]. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация проведена по методике С.В. Боронниковой [2008]. Для выявления фрагментов ДНК, общих для видов рода Adenophora, выделили ДНК из проростков A. triphylla и провели молекулярногенетический анализ с использованием ISSR- и IRAP-маркеров.

Результаты и их обсуждение

На первом этапе технологии молекулярногенетической идентификации и паспортизации в избранных для изучениях ценопопуляциях A. lilifolia были собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК и проведен ПЦР-анализ. Кроме этого, геномная ДНК была выделена из проростков двух видов рода Adenophora (A. lilifolia и A. triphylla). На втором этапе разработки технологии в изученных ценопопуляциях A. lilifolia выявлено 56 ISSR- и 149 IRAP-маркеров. Один ISSR праймер в среднем выявлял 11 маркеров, а один IRAP-праймер – 23,5 маркеров. На третьем этапе технологии были отобраны наиболее информативные для рода Adenohpora ISSR- и IRAP-праймеры. На четвертом этапе для особей двух видов рода Adenohpora (A. lilifolia, A. triphylla) выделены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. На пятом этапе идентификационные маркеры ДНК, сочетания которых характерны для ценопопуляций, были представлены в виде молекулярно-генетических формул (таблица).

Молекулярно-генетические формулы популяций A. lilifolia

Популяция	Тип фрагментов ДНК	Молекулярно-генетическая формула
Ad1	rod	Ad r1610IR 59 ; Adr840X1 0 ; Adr400M 8 ; Adr370IR 96
	vid	Adlil v 1220 IR96 ; Adlil v 1050 M8 ; Adlil v 920 X11 ; Adlil v 440 IR56
	polimorph	Adlilp1100IR 57 ; Adlilp920M1; Adlilp760IR 59 ; Adlilp670IR 56
Ad2	rod	Adr840X1 0 ; Adr400M 8 ; Adr500М1; Adr420Х 9
	vid	Adlil v 1050 M8 ; Adlil v 920 X11 ; Adlil v 800 X9
	polimorph	Adlil p 850 M1 ; Adli p 330 M1 ; Adlil p 500 Х9
Ad3	rod	Adr840X1 0 ; Adr400M 8 ; Adr500М1; Adr420Х 9
	vid	Adlil v 1050 M8 ; Adlil v 920 X11 ; Adlil v 800 X9
	polimorph	Adlil p 700 M1 ; Adlil p 400 Х11
Ad4	rod	Adr 840X1 0 ; Adr400M 8 ; Adr500М1; ; Adr420Х 9
	vid	Adlil v 1050 M8 ; Adlil v 920 X11 ; Adli v 800 X9
	polimorph	Adlilp750М 8 ; Adlilp600Х11

Для паспортизации рода Adenohpora отобрали по 4 фрагмента ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода. Запись фрагмента ДНК в соответствии с предложенной нами ранее методикой молекулярно-генетической паспортизации [Борон-никова, 2008] проводилась с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания нижним индексом праймера. Выявленные фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adenohpora , названы «родовыми» и обозначены первыми буквами названия рода Ad с указателем «r» от «rod» нижним индексом. Полиморфные фрагменты ДНК обозначены индексом «p» от «polimorph».

На шестом этапе помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетического паспорта популяций использовалась графическая запись в виде штрих-кода (рисунок).

На седьмом этапе рекомендуется составление генетического паспорта популяции. Нами разработана форма генетического паспорта популяции редкого вида растений, избраны общепринятые показатели состояния популяций и генетического разнообразия.

Среди изученных ценопопуляций A. lilifolia типичным генофондом обладает третья ценопопуля-ция (Ad3), так как содержит типичные для региона исследований аллели. К объектам сохранения со специфичными характеристиками генофондов относится ценопопуляция A. lilifolia, расположенная на горе Подкаменной (Ad1), так как содержит наи- большее число редких, нетипичных для изучаемого региона аллелей. Первая и третья ценопопуля-ции A. lilifolia рекомендуются в качестве объектов для сохранения генетического разнообразия этого вида в Пермском крае.

Заключение

Основным результатом технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации редких видов растений является механизм обобщения данных молекулярно-генетического анализа посредством выявления идентификационных маркеров. Результаты кластеризации представляются в обобщенном виде молекулярногенетической формулы и штрихкода, вносятся наряду с общепринятыми показателями состояния ценопопуляции и характеристикой ее генетического разнообразия в генетический паспорт. Новый способ записи содержит полную информацию об идентификационном молекулярном маркере, включая вид растения, тип молекулярного маркера, его размер и характеристику исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера. Методика генетической паспортизации на основе ISSR- и IRAP-маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации как набора маркеров, так и техники выполнения анализа.

Данная методика может найти применение как при разработке мер охраны и восстановления природных ценопопуляций, так и при идентификации растительного сырья лекарственных растений, яв-

Маркер молекулярной Штрихкод массы, пн

900 ____________ ляется относительно недорогой и при наличии эффективных IRAP-праймеров пригодна для массового анализа.

№ фрагмента ДНК 1

Обозначение фрагмента Ad_r 1610 _IR 59

3                Ad.lil р 1110 IR57

4               Ad.lil v 1050 M8

• 5                 Ad.lil v 930 X11

• 6                Ad.lil p 920 M1

• 7                Ad_r 840 _X1 0

• 8                 Ad.lil_р 760 _IR 59

• 9                 Ad.lil_р 670 _IR 56

11               Ad r 400 M8

12                Ad_r 370 _IR 96

Штрих-код первой популяции A. lilifolia ( Ad1 ):

Для сохранения популяционных генофондов A. lilifolia в Пермском крае рекомендованы третья ценопопуляция ( Ad3 ) с типичным генофондом и первая ценопопуляция ( Ad1 ), обладающая специфическим генофондом.

Работа выполнена в рамках государственного задания на оказание услуг, финансируемых Министерством образования и науки РФ из средств федерального бюджета.