Молекулярно-генетическая идентификация популяций Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. в Пермском крае с использованием SNP-маркеров

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 575.2:575.22:574.3                              

В настоящее время применение ДНК-маркирования основных лесообразующих видов растений рассматривается как основной инструмент для генетического контроля происхождения древесины и формирования современной системы управления лесонасаждениями [1]. Одной из основных для лесного хозяйства является проблема незаконной заготовки древесины и экспертного доказательства ее происхождения [2]. Генетический тест — это единственно возможный точный способ контроля древесины на всех этапах ее переработки [3–4]. Для разработки генетических маркеров необходимо провести фундаментальные исследования и поиск эффективных стабильных полиморфизмов различных структурных элементов геномов [5]. В связи с этим разрабатываются методики, базирующиеся на использовании различных молекулярных маркеров [3, 6].

Для генетического анализа выбран вид из рода Larix Mill., в связи с тем, что он считается наиболее распространенным во всем мире, включая и Российскую Федерацию [7]. На Урале род Larix представлен западной расой лиственницы сибирской Larix sibirica Ledeb. [8]. Одним из наиболее широко распространенных, экономически важных лесообразующих видов растений, играющих исключительно важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем [9], является сосна обыкновенная ( Pinus sylvestris L.), поэтому ее популяции также исследованы в Пермском крае.

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)-маркеры относятся к наиболее полиморфному типу маркеров, поэтому они подходят для идентификации как видов, так и отдельных популяций. Кроме этого, эти маркеры обладают высоким потенциалом для автоматизации анализа [10]. Ранее на территории Пермского края изучение древесины сосны обыкновенной на популяционном уровне с использованием SNP-маркеров не проводились. У популяций лиственницы сибирской на Урале полиморфизм SNP-маркеров уже был изучен [11–12], но не проводилась молекулярно-генетическая идентификация древесины отдельных популяций с использованием SNP-маркеров.

Цель работы — определение нуклеотидных последовательностей и отбор идентификационных SNP-маркеров для молекулярно-генетической идентификации древесины P. sylvestris и L. sibirica на популяционном уровне в Пермском крае.

Материалы и методы исследований

Молекулярно-генетический анализ древесины проведен в популяциях двух видов хвойных растений, произрастающих в Пермском крае. У L. sibirica исследованы популяции из Добрянского ( Pol , 58,2998 с. ш.), Чердынского ( Che , 60,5147 с. ш.), Красновишерского ( Krv , 60,3264 с. ш.), Гаинского ( Gai , 60,1739с. ш.) и Осинского ( Osa, 57,3430 с. ш.) районов; а у P. sylvestris — из Большесосновского ( BS , 57,5317 с. ш.), Гаинского ( GN , 60,3149 с. ш.), Пермского ( UK , 57,6816 с. ш.), Карагайского ( KR , 58,3360 с. ш.) и Добрянского ( PL , 58,2998 с. ш.) районов. Среди изученных популяций лиственницы сибирской на большем географическом расстоянии (326 км) находятся популяции Osa и Gai, а на наименьшем — Krv и Che (68 км). Географически более удалены (309 км) популяции GN и BS сосны обыкновенной, а популяции BS и UK этого вида расположены на расстоянии 64 км друг от друга.

У P. sylvestris собраны пробы древесины с 145 деревьев из 5 популяций, а у L. sibirica — с 148 деревьев из 5 популяций. Для молекулярно-генетической идентификации керны были собраны с каждого из 28-30 деревьев во всех изученных 10 популяциях. ДНК выделяли по методике для растительного материала [13] с модификациями для древесины хвойных растений [14]. Качество и характеристики ДНК определяли на приборе Spectrofotometr^TMNanoDrop 2000 (Thermo scientific, USA).

Для определения нуклеотидных последовательностей и отбора идентификационных SNP-маркеров в популяциях двух древесных видов растений Пермского края были протестированы 13 пар праймеров к 10 ядерным и к 3 хлоропластным локусам P. sylvestris, а также 10 пар праймеров к 10 локусам потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica. Определены нуклеотидные последовательности 3-х локусов ядерной и 3-х локусов хлоропластной ДНК P. sylvestris , а также последовательности 6 локусов ядерных адаптивно значимых генов L. sibirica. Нуклеотидные последовательности трех локусов ДНК у каждого вида были секвенированы, в среднем, у восьми деревьев из каждой популяции, отобранных по результатам ранее проведенного ISSR-маркирования [14].

После тестирования 13 пар праймеров к 10 ядерным и к 3 хлоропластным локусам P. sylvestris для идентификации популяций были отобраны 3 локуса: trnV, rpl20-rps18, psbA-trnH . Отобранные пары праймеров были амплифицированы с ДНК P. sylvestris. После тестирования десяти пар праймеров к 10 локусам потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica для идентификации популяций были отобраны 3 локуса: 4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS . Для амплификации локусов L. sibirica 4CL1-363 и sSPcDFD040B03103-274 использовали метод гнездовой ПЦР [11]. Далее продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле и экстрагировали с использованием коммерческого набора «Цитокин» (Санкт-Петербург, Россия) для использования в реакции секвенирования.

Ферментативную очистку продуктов ПЦР проводили смесью ферментов ExoI и FAST-AP (Fermentas, Литва) в отношении 0,5:1 из расчета 1,5 мкл ферментативной смеси на 5 мкл продуктов ПЦР. Реакцию ферментативной очистки проводили, так же как и для P. sylvestris , в амплификаторе GeneAmp PCRSystem 9700 (Applied Biosystems, USA) по программе: 37°C — 30 мин, 80°C — 15 мин, охлаждение до 4°C.

Для реакции сeквeнирования нуклеотидных последовательностей P. sylvestris и L. sibirica применяли набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). В качестве праймера использованы сначала прямая, а затем обратная последовательности из пары праймеров, с которой была поставлена ПЦР. Очистку продуктов реакции сeквeнирования от не вступивших в реакцию меченых нуклеотидов осуществляли с помощью набора BigDye® XTerminator^TM Purification Kit (Applied Biosystems, USA). В исследовании использовался метод автоматического ферментативного секвенирования. Капиллярный электрофорез синтезированных последовательностей проведен в ПЦР-лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГНИУ (Россия) на 24-капиллярном генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500×L (Applied Biosystems, США) в двух направлениях.

Выявление идентификационных маркеров и обозначение линий в штрихкоде проведены в соответствии с патентом на изобретение РФ «Способ молекулярно-генетической идентификации популяций древесных видов растений» [15].

Результаты и их обсуждение

При секвенировании нуклеотидных последовательностей двух видов хвойных растений проведено 360 прочтений и получено 240 нуклеотидных последовательностей. Общая длина секвенированной последовательности составила 114600 нуклеотидов для лиственницы сибирской и 71200 нуклеотидов для сосны обыкновенной. Длина выравнивания последовательностей варьировала от 360 у локуса ABA -WDS до 1395 нуклеотидов у локуса sSPcDFD040B03103-274. Суммарная длина проанализированной последовательности по трем локусам у каждого дерева составила 2865 нуклеотидов для L. sibirica и 1780 для P. sylvestris . Нуклеотидная последовательность локуса 4CL1-363 включала частичный сиквенс двух экзонов и полную последовательность одного интрона. Общая длина экзонов локуса 4CL1 — 363 составила 92,6% от всей анализируемой последовательности. В локусе sSPcDFD040B03103-274 идентифицирована полная последовательность одного экзона, который составил 14% от всей секвенированной последовательности локуса. Локус ABA-WDS включал частичный сиквенс только одного экзона. Основная часть анализированной последовательности трех локусов приходилась на экзоны (55,2%), а меньшая — на интроны и некодирующие элементы. Локус tr n V представляет собой частичную последовательность, кодирующую транспортную РНК аминокислоты Val. В локусе rpl20-rps18 частично расположены две кодирующие области рибосомальных белков L20 и S18, разделенные не кодирующим межгенным участком. Локус psbA-trnH содержит часть гена D1 ( psbA ), кодирующего белок фотосистемы II, а также межгенный спейсер, включающий в себя ген транспортной РНК аминокислоты His ( tRNA-His ). В результате межвидового выравнивания в on-line системе BLASTN 2.2.26 было выявлено более 100 высоко гомологичных последовательностей в базе данных GenBank NCBI.

Секвенированные нуклеотидные последовательности были выровнены с аналогичными последовательностями других видов, а также между собой внутри вида. Всего было обнаружено 59 полиморфных позиций в последовательностях трех локусов. Самым консервативным по результатам множественного выравнивания является локус ABA-WDS, в последовательности которого обнаружено 4 полиморфные позиции. Наибольшее число полиморфных сайтов выявлено в локусе sSPcDFD040B03103-274 — 34 замены и одна делеция (Рисунок).

В четырех из изученных популяций L. sibirica обнаружены уникальные SNPs, то есть встречающиеся только в одной популяции. В трех популяциях ( Krv, Che, Pol ) выявлено по одному уникальному SNP-маркеру, а в популяции Gai, помимо одного SNP-маркера, выявлена делеция трех нуклеотидов, пригодная для идентификации. Частота SNPs в популяции составляла в среднем 0,300.

Finns svlvestris L. 330         340         350         360         370

I I I I I

Lam sibiiica Ledeb.

720         730          740

I i I

Ps2_tn.Vf_l ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTdGbAAGTTTTCAAAT,

Ps2_tmVf_2 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTCG WAGTTTTCAAAT,

Ps2_tmVf_3 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTCG UAGTTTTCAAAT,

Ps2_tmVf_4 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTCG WAGTTTTCAAAT, Ps2_tmVf_5 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTC G WlGTTTTCAAAT;

Ls3 sSP 9 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCCCTCTCCGATTCCT/

Ls4_sSP_l AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCTCTCTCCGATTCCT/

Ls4_sSP_2

Ls4_sSP_3

Ls4 sSP 4

iTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCT CTCTCCGATTCCT^

AGTAAACAACAATTGCT6TAGTACTCTCT CTCTCCGATTCCT.

AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCT CTCTCCGATTCCT;

Ls4_sSP_5

Ls4_sSP_6

Ls4 sSP 7

AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTC T CTCTCCGATTCCT/

AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTC T CTCTCCGATTCCT/

AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTC T CTCTCCGATTCCT/

Ls4_sSP_8 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTC T CTCTCCGATTCCT/

Ls4 sSP 9 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCDCTCTCCGATTCCTZ

Ps3_tniVf_2 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTCCAAAGTTTTCAAATi

Ls5 sSP 1 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCCCTCTCCGATTCCT/

Ps3_tniVf_3 ACTTTAATATTATAA.CACAAAATCCCAGAAAAGGGTCCAAAGTTTTCAAAT,

Ls5_sSP_2 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCCCTCTCCGATTCCT/ Ls5 sSP 3 AGTAAACAACAATTGCTGTAGTACTCTCCCTCTCCGATTCCT/

Ps3_tniVf_4 ACTTTAATATTATAACACAAAATCCCAGAAAAGGGTCCAAAGTTTTCAAAT,

Рисунок. SNPs, выявленные при множественном выравнивании секвенированных последовательностей для сосны обыкновенной (справа) и лиственницы сибирской (слева).

Нуклеотидные последовательности L. sibirica общей длиной 114600 нуклеотидов внесены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: KT364889-KT365131 .

В секвенированных последовательностях двух видов растений детектировано 59 SNP-маркеров, из них 11 пригодны для идентификации популяциях двух видов хвойных растений. В секвенированных нуклеотидных последовательностях установлены уникальные идентификационные SNP-маркеры, с достаточно высокой частотой встречаемости (≥0,5) для популяций лиственницы сибирской и популяций сосны обыкновенной (Таблица 1).

Таблица 1.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИДЕНТИФИКАЦИОННЫХ ПОПУЛЯЦИОННЫХ SNP-МАРКЕРОВ ДВУХ ВИДОВ ХВОЙНЫХ РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ

Локус	SNP-маркеры
Larix sibirica Ledeb.
4CL1-363	Krv-4CL SNP1088T/A ; Gai-4CL SNP 722A/T
sSPcDFD040B03103-274	Pol-sSP SNP52T/A ; Gai-sSP Del269-271TCT ; Gai-sSP SNP729C/T ; Chr-sSP SNP1185G/T
Pinus sylvestris L.
trnV	BS-trnV SNP358C/G ; KR-trnV SNP207A/T
rpl20-rps18	BS-rps18 SNP129A/T
psbA-trnH	KR-trnH SNP402G/C ; BS-trnH SNP289T/A
Примечание: SNP — Single Nucleotide Polymorphism; Del — делеция.

С помощью выявленных при молекулярно-генетическом анализе идентификационных ISSR-PCR и SNP-маркеров были составлены молекулярно-генетические формулы популяций сосны обыкновенной и лиственницы сибирской. Например, популяция L. sibirica ( Gai ) может быть идентифицирована с помощью детекции однонуклеотидной замены А на T в 722 положении гена 4CL , при этом в записи молекулярно-генетической формулы указывается: Gai-4CL SNP 722A/T . Также для идентификации этой популяции пригодна делеция трех нуклеотидов ТСТ в гене sSP с 269 по 271 позицию. При этом в записи молекулярногенетической формулы указывается: Gai-sSP Del269-271TCT (Таблица 2).

Таблица 2.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФОРМУЛА ГАИНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ L. sibirica

Обозначение популяции	Тип                    Молекулярно-генетическая формула фрагментов
Gai	vid              LS v 420 CR-215 ;  LS v 290 CR-215 ;  LS v 255 CR-215 ;  LS v 190 CR-215 ;  LS v 550 ISSR-8 ; LS v 340 ISSR-8 ; LS v 600 M3 ; LS v 500 M3 ; LS v 370 X10 ; LS v 280 X11 ; LS v 220 X11 polimorph     GAI u 1240 X11 ; GAI u 940 X10 ; GAI u 790 X10 SNP            Gai-sSP Del269-271TCT ; Gai-sSP SNP729C/T ; Gai-4CL SNP 722A/T

Примечание: LS v — видовые маркеры, характерные для изученных популяций L. sibirica ; GAI u , — полиморфные ISSR-PCR маркеры или их сочетания, характерные для отдельных выборок лиственницы сибирской; vid — тип фрагмента, характерный для вида; polimorph — полиморфный тип фрагмента; SNP — Single Nucleotide Polymorphism и его обозначение — Gai-4CL SNP 722A/T

С использованием SNP-маркеров наряду с ISSR-PCR маркерами составлены не только молекулярно-генетические формулы, но и штрихкоды и генетические паспорта 10 популяций двух видов хвойных растений ( P. sylvestris и L. sibirica ) Пермского края.

Заключение

Были протестированы 13 пар праймеров к 10 ядерным и к 3 хлоропластным локусам P. sylvestris, а также десять пар праймеров к 10 локусам потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica. Определены последовательности 3-х локусов ядерной и 3-х локусов хлоропластной ДНК P. sylvestris , а также последовательности 6 локусов ядерных адаптивно значимых генов L. sibirica. Проведено 360 прочтений и получено 240 нуклеотидных последовательностей. Общая длина секвенированной последовательности составила 114600 нуклеотидов для лиственницы сибирской и 71200 нуклеотидов — для сосны обыкновенной.

Для молекулярно-генетической идентификации древесины в 10 популяциях двух видов хвойных растений были отобраны три локуса потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica и три локуса хлоропластной ДНК P. sylvestris . Проведено секвенирование последовательностей этих локусов и выявлены 59 SNP-маркеров, из которых 11 использованы для идентификации популяций древесины двух видов хвойных растений в Пермском крае.

С использованием ISSR- и SNP-маркеров составлены молекулярно-генетические формулы, штрихкоды и генетические паспорта 10 популяций двух видов хвойных растений ( P. sylvestris и L. sibirica ) Пермского края.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Правительства Пермского края в рамках научного проекта №С-26/174.3 от 31.01.2019.