Молекулярно-генетическая идентификация популяций Pinus sylvestrys L. на востоке Русской равнины на основании полиморфизма ISSR-маркеров

Сохранение биологического разнообразия лесов как основы стабильности экосистем является важной проблемой современности. По разным оценкам площади лесов ежегодно сокращаются на 7-9 млн га. Известно, что за счёт сокращения эффек тивной численности особей в популяциях древесных растений вследствие проведения сплошнолесосечных рубок, гибели насаждений в результате пожаров, болезней, ветровала, загрязнения окружающей среды наблюдается неуклонное снижение генетического разнообразия лесов [Geburek, Turok, 2005]. Поколения леса, возникшие в результате ес-

тественного или искусственного возобновления от ограниченного количества особей, будут генетически менее разнообразными, а, следовательно, исходя из наличия взаимосвязи уровня генетической изменчивости, с одной стороны, и интенсивности роста и гомеостазом - с другой [Левонтин, 1978; Грант, 1984], и менее продуктивными, менее устойчивыми к экологическим факторам.

Вырубка леса, в особенности несанкционированная, ликвидируя часть генотипов, неминуемо ведет к генетическому обеднению популяций и уменьшению генетического разнообразия [Ветчин-никова, Титов, Кузнецова, 2013]. Согласно данным Министерства природных ресурсов и экологии РФ, ущерб от незаконных рубок в 2014 г. составил 14 млрд руб. [Материалы ..., 2012]. Для сокращения количества несанкционированных рубок необходимы точные сведения о популяции, в которой произведена заготовка древесины. Существуют разнообразные технологии, направленные на идентификацию места происхождения древесины после ее вырубки, например, методы дендрохронологии. Однако этот подход имеет ограниченное применение [Основные ..., 2013]. В качестве альтернативы могут использоваться методы, основанные на молекулярно-генетической идентификации. Известно, что генетический контроль является наиболее надежным способом идентификации популяций и определения географического происхождения древесины [Исаев, Коровин, 2009]. В связи с этим молекулярно-генетическая идентификация популяций хвойных видов растений является весьма актуальной.

Материал и методы

Молекулярно-генетическая идентификация проведена у четырех популяций Р. sylvestris, которые расположены на востоке Русской равнины: Psi - около пос. Мордино Республики Коми, Ps2 -около пос. Визинга Республики Коми, Ps3 - из Шабалинского лесничества Кировской обл., Ps4 -из Ежихинского лесничества Кировской обл. Для проведения исследований материал собирался в каждой популяции индивидуально с 46 деревьев, расположенных на расстоянии не менее 100 м друг от друга. Молекулярно-генетический анализ и выявление идентификационных молекулярных маркеров проводилось по результатам ПЦР с пробами ДНК, выделенными как из хвои, так и из древесины.

Для молекулярно-генетического анализа Р. sylvestris был избран ISSR (Inter Simple Sequence Нереа1$)-метод [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994]. Метод основан на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида, состоящих из тандемных коротких 2-4 нуклео тидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера [Боронникова, Календарь, 2010]. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра SmartSpecTM Plus Nano Drop («BioRad», USA). Праймеры для ПЦР синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва). Тотальная ДНК выделена из древесины и хвои 184 деревьев с использованием модифицированной нами методики выделения ДНК СО. Роджерса и Э. Дж. Бендича [Rogers, Bendich, 1985] в которой в качестве сорбента использовался PVPP, то есть поливинилполипирролидон [Нечаева, 2011]. При выделении ДНК брали навеску 100 мг. Для ПЦР-анализа использовали пробы с концентрацией 5 нг/мкл. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», USA) по типичной для ISSR-метода программе [Боронникова, 2009]. Температура отжига в зависимости от G/C-состава праймеров варьировала от 46 до 64°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее трех раз. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1.7%-ном агарозном геле в lx ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder; «ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).

Результаты и их обсуждение

При молекулярно-генетическом анализе Р. sylvestris выявлено 117 ISSR-маркеров (табл. 1), из которых 111 были полиморфными (Ру- = 0.949). Число ISSR-маркеров Р. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер М27) до 21 (праймеры ХЮ и CR215), а их размеры - от 150 до 1400 пн. В среднем один ISSR-праймер инициировал у Р. sylvestris синтез 16.7 ISSR-маркеров. Число полиморфных маркеров в общей выборке Р. sylvestris варьировало от 19 до 28, а доля полиморфных локусов в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0.880 до 1.000. Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях Р. sylvestris выявлено 16 редких ISSR-маркеров, из которых в популяции Psi выявлено 7, в популяции Ps2 - 3, в популяции Ps3 - 2, а в популяции Ps4 - 4 уникальных ISSR-маркеров.

Для молекулярно-генетической идентификации отобраны наиболее информативные ISSR-праймеры, с помощью которых выявлены родовые (надвидовые), видовые и полиморфные ISSR-маркеры и про веден отбор идентификационных молекулярных маркеров, а также определены их сочетания для идентификации популяций (табл. 2).

Таблица 1

Характеристика ISSR-маркеров в четырех популяций Р. sylvestris

ISSR-праймеры	Нуклеотидная последовательность (5'^ 3')	Длина фрагментов, пн	Число полиморфных ISSR-маркеров в популяциях
			Psi	Ps2	Ps3	Ps4	на общую выборку
							всего	полиморфных
ISSR-1	(АС)8Т	220-1115	И (0.733)	12 (0.857)	9 (0.563)	8 (0.533)	20	20 (1.000)
CR-212	(CT)8TG	250 1400	12 (0.706)	12 (0.750)	6 (0.462)	8 (0.500)	25	22 (0.880)
CR-215	(CA)6GT	150 1280	18 (0.857)	18 (0.900)	8 (0.533)	8 (0.533)	22	22 (1.000)
М27	(GA)8C	1501020	И (0.647)	9 (0.642)	7(0.438)	6 (0.400)	21	19 (0.905)
ХЮ	(AGC)6C	200 1400	13 (0.722)	21 (0.913)	9 (0.529)	10 (0.588)	29	28 (0.966)
Всего ISSR-маркеров (в скобках - их частота)			65 (0.739)	72 (0.827)	39 (0.506)	40 (0.513)	117	111 (0.949)

Таблица 2

Характеристика идентификационных ISSR-маркеров популяций Р. sylvestris

Обозначение праймера

Нуклеотидная последовательность (5'^ 3')

Размеры ISSR-маркеров, пн

ISSR-маркеры, избранные для паспортизации

Мономорфные ISSR-маркеры

CR-212	(CT)8TG	1400-250	PSv670CR212 PSv450CR212 PSv390CR212
М27	(GA)8C	1020-150	PSv500M27 PSv460M27
ХЮ	(AGC)6C	1400-200	PSv440X10

Полиморфные ISSR-маркеры

ISSR-1	(AC)8T	1115-220	Pslp930ISl
CR-212	(CT)8TG	1400-250	Pslp260CR212 Ps4p290CR212 Ps4p250CR212
CR-215	(CA)6GT	1280-150	Ps3pl400CR215 Ps3pl200CR215
M27	(GA)8C	1020-150	Pslp210M27Pslpl80M27 Pslpl70M27 Ps2p350M27
X10	(AGC)6C	1400-200	Ps3p410X10 Ps2p250X10 Ps2p200X10 Ps4pl650X10 Ps4p900X10

Примечание. PSv - ISSR-маркеры, характерные для всех популяций; Pslp, Ps2p, Ps3p и Ps4p - полиморфные ISSR-маркеры, характерные для отдельных популяций.

Молекулярные маркеры, избранные для идентификации четырех популяций Р. sylvestris, представлены в виде молекулярно-генетической формулы, при составлении которой использовались так называемые «видовые» и «полиморфные» ISSR-маркеры. «Родовые» ISSR-маркеры использованы не были, так как для их обнаружения необходимо исследовать как минимум еще один вид рода Pinus. Мономорфные ISSR-маркеры, характерные для вида, обозначены как PSv а полиморфные как Pslp - для популяции Psi, Ps2p - для популяции Ps2, Ps3p - для популяции Ps3, Ps4p - для популяции Ps4. Основная характеристика молекулярного маркера (его длина) указана большими буквами после указания типа маркера -Pslp260CR2i2. В молекулярно-генетической форму ле приведены тип и номер праймера нижним индексом. Так, молекулярный маркер Ps3pl200CR2i5 выявлен ISSR-методом с использованием праймера CR215. В случае, когда праймер возможно записать в виде короткой формулы как при ISSR-анализе, запись молекулярного маркера можно представить в следующем виде Ps3pl200(CA)6GT-Данная форма записи молекулярного маркера является самой информативной. Таким образом, в предлагаемой записи молекулярно-генетической формулы указан вид растения, тип амплифициро-ванного ISSR-маркера, его размер и дана характеристика исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера.

Для изученных популяций Р. sylvestris установлены шесть видовых ISSR-маркеров, выявленные у всех изученных популяций: PS_v670_Cr212 PSv500M2 PS_v460_M27 PS_v450_Cr212 PS_v44Oxio PS_v390cr212- На основе ISSR-спектров удалось установить идентификационные ISSR-маркеры или их сочетания для популяций, с достаточно высокой частотой встречаемости в популяции. Для популяции Psi идентификационными маркерами являются Pslp93O_ISi

Pslp260_CR212 Pslp210_M27 PslplS0_M27 Pslpl70_M27; для популяции Ps2 - Ps2p350_M27 Ps2p25O_Xio Ps2p2OO_Xio; Для Ps3 - Ps3pl400_CR2i5 Ps3pl200_CR2i5 Ps3p41O_Xio; Для Ps4 - Ps4pl65O_Xio Ps4p9OO_Xio Ps4p290_CR2i2 Ps4p250_CR2i2- На основании полученных данных были составлены молекулярногенетические формулы для изученных популяций Р. sylvestris (табл. 3).

Таблица 3

Молекулярно-генетические формулы четырех популяций Р. sylvestris

Популяции	Тип ISSR-маркера	ISSR-маркеры, избранные для паспортизации
Psi	vid	PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212
	polimorph	Pslp930ISl Pslp260CR212 Pslp210M27 Pslpl80M27 Pslpl70M27
Ps2	vid	PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212
	polimorph	Ps2p350M27 Ps2p250X10 Ps2p200X10
Ps3	vid	PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212
	polimorph	Ps3pl400CR215 Ps3pl200CR215 Ps3p410X10
Ps4	vid	PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27 PSv450CR212 PSv440X10 PSv390CR212
	polimorph	Ps4pl650X10 Ps4p900X10 Ps4p290CR212 Ps4p250CR212

Примечание. PSv - ISSR-маркеры, характерные для всех популяций; Pslp, Ps2p, Ps3p и Ps4p - полиморфные ISSR-маркеры, характерные для отдельной популяции; vid - видовые ISSR-маркеры; polymorph - полиморфные ISSR-маркеры.

На основании полученных молекулярногенетических формул рекомендуется составлять штрихкоды [Боронникова, 2013]. Как молекулярно-генетическая формула, так и штрихкод позволят идентифицировать принадлежность особей не только к роду и виду, но и к определенной популяции.

Родовые маркеры предлагается обозначить толстой линией, видовые - линией средней толщины, а полиморфные маркеры - тонкой линией. Для штрихкода предлагается использовать от 9 до 12 штрихов. ISSR-маркеры в штрихкоде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему (рисунок).

Маркер _____ молекулярной массы, пн

700 ________________________

	№ ISSR-	Обозначение
Штрихкод
	маркера	маркера
—	1	Ps3pl400CR215
—	2	Ps3pl200CR215
	3	1jSv67UcR212
	4	PSv500m2?
	5	Р^ДбОрр'т
	6	Р^Д^Ог’пою
	7	РКуДДОхпп
—	8	Ps3p4 lOxio
	9	PSv390cr212

Штрихкод популяции Ps3, расположенной в Шабалинском лесничестве Кировской обл.

Таким образом, в основу методики молекулярно-генетической идентификации популяций заложен молекулярный анализ высоко полиморфных областей геномов изучаемых видов. Молекулярногенетическая идентификация популяций включает в себя молекулярно-генетический анализ на основании полиморфизма ISSR-маркеров, выявление идентификационных маркеров, редких и уникаль ных аллелей, составление для каждой популяции молекулярно-генетической формулы и штрихкода.

Заключение

У четырех изученных популяций Р. sylvestris выявлено 117 ISSR-маркеров. Установлено, что доля полиморфных локусов у этих популяций высока (Р95 = 0.949), поэтому они могут быть исполь- зованы для идентификации на популяционном уровне. Выявлены идентификационные видовые для Р. sylvestris и полиморфные ISSR-маркеры, а также их сочетания для молекулярно-генетической идентификации изученных популяций. Составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды четырех изученных популяций Р. sylvestris. Полученные данные могут быть использованы для идентификации популяций и древесины Р. sylvestris в изученных регионах.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Участник молодежного научноинновационного конкурса» (УМНИК) Фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере» 2016-2018 гг., договор № 9000ГУ/2015 от 22.12.2015.