Молекулярно-генетическая идентификация в лесном хозяйстве с использованием геномных технологий

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 4. №7. 2018

Популяции древесных растений занимают большие площади и, как правило, генотипы их растений более однотипны при сопоставлении с популяциями травянистых растений. Древесные растения имеют большую продолжительность жизни. Эти особенности древесных растений необходимо учитывать при характеристике генофондов, в том числе при описании их специфичности. Несмотря на то, что лес — возобновляемый ресурс, количество вырубок превышает количество новых посадок (возобновлений) [1]. Древесина является высококачественным энергетическим и трудно заменимым материалом, использующимся в строительстве, мебельной промышленности и других сферах деятельности [2, с. 115–119].

В современный период широкое распространение получило такое преступление, как незаконная рубка лесных насаждений (1). Неконтролируемая вырубка лесов приводит к уничтожению среды обитания живых организмов, эрозии почв, а в глобальном масштабе — к изменению климата (2). Согласно данным Министерства природных ресурсов и экологии РФ ущерб от незаконных рубок в 2014 г. составил 14 млрд руб. [3].

Существуют разнообразные технологии, направленные на идентификацию места происхождения древесины после ее вырубки [4].

Материалы и методы исследований

Молекулярно–генетическая идентификация проведена у шести популяций P. sylvestris , которые расположены на востоке Русской равнины: Ps1 — около п. Мордино Республики Коми, Ps2 — около п. Визинга Республики Коми, Ps3 — из Шабалинского лесничества Кировской области, Ps4 — из Ежихинского лесничества Кировской области, Ps5 — из Даровского лесничества, Кировской области; Ps6 — из Юрьянского лесничества, Кировской области. Молекулярно–генетический анализ и выявление идентификационных молекулярных маркеров проводилось по результатам ПЦР с пробами ДНК, выделенными как из хвои, так и из древесины.

Для проведения исследований собраны свежие вегетативные почки латеральных побегов индивидуально с 46 деревьев каждой популяции расположенных на расстоянии не менее 100 м. друг от друга. Тотальная ДНК выделена из хвои 276 деревьев с использованием модифицированной нами методики выделения ДНК С. O. Роджерса и Э. Дж. Бендича в котором в качестве сорбента использовался PVPP, то есть поливинилполипирролидон [5, с. 69–76].

Качество и характеристики ДНК определяли на приборе Spectrofotometr^TM NanoDrop 2000 («Thermo scientific», USA). Молекулярно–генетическое анализ был проведены с применением ISSR (Inter Simple Sequence Repeats [7]) — метода полиморфизма ДНК. Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq –полимеразы; 2,5 мкл 10х буфера + MgCl 2 («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 0,25 мM dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл ДНК. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) с пятью ISSR–праймерами, эффективными для P. sylvestris : ISSR-1 ((АС) 8 T), CR-212 ((CT) 8 TG), CR-215 ((CA) 6 GT), M27 ((GA) 8 C), X10 ((AGC) 6 C).

В процессе ПЦР пробы ДНК амплифицировались по общепринятой для ISSR–метода программе: начальная денатурация 94 C, 2 мин.; первые 5 циклов 94 С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 С, 10 сек.; в дальнейших 35 циклах 94 С, 5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров изменялась от 54°С до 64°С. Для определения чистоты реактивов в качестве К — в реакционную смесь добавляли взамен ДНК 5 мкл деионизированной воды. Ампликоны разъединяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в 1× TBE буфере, окрашивали бромистым этидием. Для определения длин амликонов выбрали маркер молекулярной массы (100 bp + 1.5 + 3 Кb DNA Ladder, (ООО «СибЭнзим–М», Москва).

Фотографирование и подсчет длин ампликонов проводили с помощью системы гель– документации GelDoc, а также программы Quantity One («Bio–Rad», USA). Проведено молекулярно–генетическое тестирование 135 ISSR–PСR маркеров у 276 деревьев P. sylvestris , в матрице рассмотрены 37 260 позиций.

Генетическая идентификация была проведена по методике, предложенной С. В. Боронниковой с соавтором на примере природных популяций двух видов Populus tremula L. и Populus balsamifera L. [6].

Результаты и их обсуждение

При молекулярно–генетическом анализе P. sylvestris выявлено 135 ISSR–PCR маркеров, из которых 128 были полиморфными (P 95 =0,948). Число ISSR–PCR маркеров P. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер M27) до 31 (праймер X10) а их размеры — от 150 до 1650 п. н. В среднем один ISSR–праймер инициировал у P. sylvestris синтез 16,7 ISSR–PCR маркеров. Число полиморфных маркеров в общей выборке P. sylvestris варьировало от 23 до 28, а доля полиморфных локусов в зависимости от ISSR–праймера колебалась от 0,903 до 1,000 (Таблица 1).

Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 9 редких ISSR–PCR маркеров, из которых в популяциях Ps1, Ps2 и Ps6 по одному ISSR–PCR маркеру, в популяциях Ps3 и Ps4 — по 3 уникальных ISSR–PCR маркеров, а в популяции Ps5 уникальных ISSR–PCR маркеров не обнаружено. Для молекулярно– генетической идентификации отобраны наиболее информативные ISSR–праймеры, с помощью которых выявлены видовые и полиморфные ISSR–маркеры и проведен отбор идентификационных молекулярных маркеров, а также определены их сочетания для идентификации популяций (Таблица 2).

Таблица 1.

ХАРАКТЕРИСТИКА ISSR–PCR МАРКЕРОВ В ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ P. sylvestris

	Нуклео-		Число полиморфных ISSR–PCR маркеров в популяциях
ISSR– праймеры	тидная последо-	Длина маркеров, п. н.	На общую выборку
	ватель-		Ps1     Ps2    Ps3    Ps4    Ps5    Ps6          поли-
	ность (5´→ 3´)		все- морфных

			11	12	9	8	18			23
ISSR-1	(АС) 8 T	220–1350	(0,733)	(0,857)	(0,563)	(0,533)	(0,857)	(0,714)	24	(0,958)
CR-212	(CT) 8 TG	230–	12	12	6	8	21	20	27	26
		1550	(0,706)	(0,750)	(0,462)	(0,500)	(1,000)	(0,952)		(0,963)
CR-215	(CA) 6 GT	150–	18	18	8	8	17	14	26	26
		1200	(0,857)	(0,900)	(0,533)	(0,533)	(0,850)	(0,700)		(1,000)
M27	(GA) 8 C	150–	11	9	7	6	16	15	27	25
		1020	(0,647)	(0,642)	(0,438)	(0,400)	(0,727)	(0,682)		(0,926)
X10	(AGC) 6 C	210–	13	21	9	10	19	22	31	28
		1650	(0,722)	(0,913)	(0,529)	(0,588)	(0,826)	(0,917)		(0,903)
Всего ISSR–маркеров (в			65	72	39	40	90	86	135	128
скобках дана их частота)			(0,739)	(0,827)	(0,506)	(0,513)	(0,841)	(0,796)		(0,948)

Примечание: Ps1 — популяция, расположенная около п. Мордино Республики Коми, Ps2 — популяция, расположенная около п. Визинга Республики Коми, Ps3 — популяция, из Шабалинского лесничества Кировской области, Ps4 — популяция, из Ежихинского лесничества Кировской области, Ps5 — из Даровского лесничества, Кировской области; Ps6 — из Юрьянского лесничества, Кировской области

Таблица 2.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИДЕНТИФИКАЦИОННЫХ ISSR–PCR МАРКЕРОВ ПОПУЛЯЦИЙ

P. sylvestris

Обозначение праймера	Нуклеотидная последовательность (5´→ 3´)	Размеры ISSR–PCR маркеров, п. н.	ISSR–PCR маркеры, избранные для идентификации
Мономорфные ISSR–PCR маркеры
CR-212	(CT) 8 TG	1550–2530	PSv670 CR212 PSv450 CR212 PSv390 CR212
M27	(GA) 8 C	1020–150	PSv500 M27 PSv460 M27
X10	(AGC) 6 C	1650–210	PSv440 X10
Полиморфные ISSR–PCR маркеры
ISSR-1	(АС) 8 T	1350–220	Ps6 p 1115 IS1 Ps1p930 IS1 Ps5 p 800 IS1
CR-212	(CT) 8 TG	1550–230	Ps6 p    880 CR212   Ps6 p 420 CR212    Ps4p290 CR212 Ps1p260 CR212 Ps4p250 CR212
CR-215	(CA) 6 GT	1200–150	Ps3p1400 CR215 Ps5 p 1250 CR215 Ps3p1200 CR215
M27	(GA) 8 C	1020–150	Ps1p210 M27      Ps1p180 M27      Ps1p170 M27 Ps2p350 M27 Ps4p1650 X10 Ps4p900 X10 Ps6 p 770 X10 Ps6 p 720 X10
X10	(AGC) 6 C	1650–210	Ps3p410 X10 Ps5 p 300 X10 Ps2p250 X10 Ps5 p 230 X10 Ps2p200 X10

Примечание: PSv — ISSR–PCR маркеры, характерные для всех популяций; Ps1p, Ps2p, Ps3p и Ps4p — полиморфные ISSR–PCR маркеры, характерные для отдельных популяций.

Молекулярные маркеры, избранные для идентификации четырех популяций P. sylvestris , представлены в виде молекулярно–генетической формулы, при составлении которой использовались так называемые «видовые» и «полиморфные» ISSR–PCR маркеры.

«Родовые» ISSR–PCR маркеры использованы не были, так как для их обнаружения необходимо исследовать еще один вид рода Pinus . Мономорфные ISSR–PCR маркеры, характерные для вида, обозначены как PSv , а полиморфные как: Ps1p — для популяции Ps1, Ps2p — для популяции Ps2, Ps3p — для популяции Ps3, Ps4p — для популяции Ps4. Основная характеристика молекулярного маркера (его длина) указана большими буквами после указания типа маркера — Ps1p260 CR212 . В молекулярно–генетической формуле приведены тип и номер праймера нижним индексом. Так, молекулярный маркер Ps3p1200 CR215 выявлен ISSR–методом c использованием праймера CR215. В случае, когда праймер возможно записать в виде короткой формулы как при ISSR–анализе, запись молекулярного маркера можно представить в следующем виде Ps3p1200 (CA)6GT . Данная форма записи молекулярного маркера является самой информативной.

Таким образом, в предлагаемой записи молекулярно–генетической формулы указан вид растения, тип амплифицированного ISSR–PCR маркера, его размер и дана характеристика исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера.

Для изученных популяций P. sylvestris установлены шесть видовых ISSR–PCR маркеров, выявленные у всех изученных популяций: PS v 670 CR212 , PSv500M2, PS v 460 M27 , PS v 450 CR212 , PS v 440 X10 , PS v 390 CR212 . На основе ISSR–спектров удалось установить идентификационные ISSR–PCR маркеры или их сочетания для популяций, с достаточно высокой частотой встречаемости в популяции. Для популяции Ps1 идентификационными маркерами являются Ps1p930 IS1 , Ps1p260 CR212 , Ps1p210 M27 , Ps1p180 M27 , Ps1p170 M27 ; для популяции Ps2 — Ps2p350 M27 Ps2p250 X10 Ps2p200 X10 ; для Ps3 — Ps3p1400 CR215 Ps3p1200 CR215 Ps3p410 X10 ; для Ps4 — Ps4p1650 X10 Ps4p900 X10 Ps4p290 CR212 Ps4p250 CR212 ; для популяции Ps5 — Ps5 p 1250 CR215 ; Ps5 p 800 IS1 ; Ps5 p 300 X10 ; Ps5 p 230 X10 ; для популяции Ps5 — Ps6 p 1115 IS1 ; Ps6 p 880 CR212 ; Ps6 p 770 X10 ; Ps6 p 720 X10 ; Ps6 p 420 CR212 . На основании полученных данных были составлены молекулярно–генетические формулы для изученных популяций P. sylvestris (Таблица 3).

Таблица 3.

МОЛЕКУЛЯРНО–ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФОРМУЛЫ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ P. sylvestris

Ps1	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps1p930 IS1 Ps1p260 CR212 Ps1p210 M27 Ps1p180 M27 Ps1p170 M27
Ps2	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps2p350 M27 Ps2p250 X10 Ps2p200 X10
Ps3	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps3p1400 CR215 Ps3p1200 CR215 Ps3p410 X10
Ps4	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps4p1650 X10 Ps4p900 X10 Ps4p290 CR212 Ps4p250 CR212
Ps5	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps5 p 1250 CR215 ; Ps5 p 800 IS1 ; Ps5 p 300 X10 ; Ps5 p 230 X10
Ps6	vid	PSv670 CR212 PSv500 M27 PSv460 M27 PSv450 CR212 PSv440 X10 Sv390 CR212
	polymorph	Ps6 p 1115 IS1 ; Ps6 p 880 CR212 ; Ps6 p 770 X10 ; Ps6 p 720 X10 ; Ps6 p 420 CR212

Примечание: PSv — ISSR–PCR маркеры, характерные для всех популяций; Ps1p, Ps2p, Ps3p, Ps4p,

Ps5p и Ps6p — полиморфные ISSR–PCR маркеры, характерные для отдельной популяции.

На основании полученных молекулярно–генетических формул рекомендуется составлять штрихкоды [7]. Как молекулярно–генетическая формула, так и штрихкод позволят идентифицировать принадлежность особей не только к роду и виду, но и к определенной популяции.

Родовые маркеры предлагается обозначить толстой линией, видовые — линией средней толщины, а полиморфные маркеры — тонкой линией. Для штрихкода предлагается использовать от 9 до 12 штрихов. ISSR–PCR маркеры в штрихкоде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему (Рисунок).

Маркер мол. массы, п. н.	Штрихкод	№ ISSR–PCR маркера	Обозначение маркера
1500 1000 900 800 700 600 500		1 2 3 4 5	Ps3p1400CR215 Ps3p1200CR215 PSv670CR212 PSv500M27 PSv460M27    PSv450CR212
400		6 7 8 9	PSv440X10 Ps3p410X10 PSv390CR212

Рисунок. Штрих–код популяции Ps3, расположенной в Шабалинском лесничестве Кировской области.

Заключение

Таким образом, в основу методики молекулярно–генетической идентификации популяций заложен молекулярный анализ высоко полиморфных областей геномов изучаемых видов. Молекулярно–генетическая идентификация популяций включает в себя молекулярно– генетический анализ на основании полиморфизма ISSR–PCR маркеров, выявление идентификационных маркеров, редких и уникальных аллелей, составление для каждой популяции молекулярно–генетической формулы и штрихкода.