Молекулярно-генетические нарушения как критерии в дифференциальной диагностике редких опухолей почки

121108, Россия, Москва, ул. Ивана Франко, д. 4, корп. 15, оф. 9 Тел.: +7 (495) 380-00-80; Факс: +7 (495) 780-31-11

PAJUNK

EpiSpin Lock - наборы для комбинированной спино-эпидуральной анестезии

Оригинальная игла SPROTTE® спинальных игл

Фрагментный анализ. Аллели STR-маркеров определяли методом фрагментного анализа 0,5-4 мкл ПЦР-продуктов с использованием стандарта молекулярной массы LIZ500 и полимера РОР4 на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 («Applied Biosystems», США) согласно руководствам фирмы-производителя.

Секвенирование ПЦР-продукта. ПЦР-продукт объемом 7 мкл обрабатывали смесью 5 ед. экзонуклеазы I из E.coli и 1 ед. щелочной фосфатазы, затем проводили секвенирование с помощью набора ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 и генетического анализатора ABI PRISM 3100 по протоколам фирмы «Applied Biosystems». Идентификацию мутаций и полиморфизмов проводили с помощью интерактивной базы данных HGMD .

Статистическая обработка результатов. Для формирования критерия дифференциальной диагностики хромофобной карциномы и онкоцитомы использовали классификационный анализ с обучением, основанный на модели логистической регрессии с регуляризацией. Точный двусторонний критерий Фишера (программа GraphPad InStat v. 3.05.) использовали при сравнении частот аллельного дисбаланса и микросателлитной нестабильности в различных типах опухолей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ доступной литературы показал, что критерии для дифференциальной диагностики хромофобной карциномы и онкоцитомы с помощью

Рис. 1. Аллельный дисбаланс по локусу D13S1742 в хромофобной карциноме

микросателлитов целесообразно формировать на основе исследования хромосом 1q, 2, 6p, 10, 13q, 17p и 21q, показывающих наиболее выраженные различия по количеству копий между хромофобной карциномой и онкоцитомой [5-7]. Каждая из этих областей была проанализирована по 1-2 STR-маркерам. Основными критериями отбора, помимо локализации, были структура простого тандемного повтора (совершенный повтор с единицей 3-5 нуклеотидов) и наличие информации в базах данных о его полиморфизме.

Поиск подходящих локусов проводили с помощью интерактивной программы UCSC Genome Browser , в результате которого сформировали панель из 12 тетрануклеотидных STR-маркеров. Генотипирование проводили с помощью ПЦР, в которой один из праймеров в каждой паре был конъюгирован с флуоресцентным красителем, и последующего фрагментного анализа меченых ПЦР-продуктов на капиллярном генетическом анализаторе ABI3100 «Applied Biosystems» (США). Значение аллельного дисбаланса, где площади пиков опухолевого образца были нормализованы по сигналам этих же аллелей от нормальной ткани для корректировки эффекта преимущественной амплификации более короткого аллеля, вычисляли по формуле:

^1Т

^1N ^ZN где:

AI –показатель аллельного дисбаланса, S1T и S2T – площади пиков от первого и второго аллелей в опухолевом образце, S1N и S2N – площади пиков от первого и второго аллелей в образце нормальной ткани (рис 1). Значение AI при этом могло изменяться в интервале [0;1], если AI находился в границах [0;0,3)U(0,7;1], то считали, что в образце опухолевой ткани присутствует аллельный дисбаланс. Хотя фирма “Applied Biosystems” предлагает проводить вычисления потери гетерозиготности (частный случай аллельного дисбаланса) по высотам пиков [13], ряд работ основаны на вычислении отношений площадей пиков как показателей, характеризующих количество ПЦР-продуктов, а не их концентрацию в зоне локального максимума при капиллярном электрофорезе [14, 15]. Эти подходом руководствуются и мы, анализируя площади пиков, соответствующих аллелям исследуемых STR-маркеров. Результаты генотипирования парных образцов (опухоль и прилегающая нормальная ткань от каждого из 4 пациентов с хромофобной карциномой и 3 пациентов с онкоцитомой) представлены в таблице 2. При генотипировании в образцах также выявляли микросателлитную нестабильность – аберрантные аллели STR-маркера в опухолевой ткани, которые отсутствуют в нормальной ткани и возникают вследствие ошибок репликации простых тандемных повторов при инактивированной системе репарации неспаренных оснований [16].

Показано, что аллельный дисбаланс и/или микросателлитная нестабильность по двум и более локусам из 10 встречаются во всех хромофобных карциномах, тогда как в онкоцитомах отсутствуют нарушения в тестируемых STR-маркерах (точный двусторонний критерий Фишера, р=0.029 при α=0.05). Далее аллельный дисбаланс интерпретировали как количественную переменную, преобразованную с помощью функции Y = I AI - 0,5 I в значение от 0 до 0,5. Образцам, в которых была выявлена только микросател-литная нестабильность, придавалось значение 0,5 для того, чтобы это нарушение можно было учитывать на- ряду с аллельным дисбалансом. Неинформативным случаям (гомозиготам) приписывали пограничное значение 0,2. Нарушения в хромосомах, анализируемых по двум STR-маркерам, коррелируют друг с другом (кроме неинформативных локусов). Поэтому для уменьшения эффекта переобучения из каждой анализируемой хромосомы был выбран локус с большим числом нарушений в образцах хромофобной карциномы, и была сформирована панель из 7 STR-маркеров: D1S2142, D2S1782, GAAT3A06, D10S2469, D13S634, D17S1298 и D21S11. Далее применяли метод классификационного анализа с обучением, основанный на модели логистической регрессии с регуляризацией. Решающее правило имеет следующий вид:

где:

Y = 1 для хромофобной карциномы и Y = 0 для онкоцитомы, X – вектор значений от 0 до 0,5, в которые был преобразован AI, θ – вектор с оптимизированными параметрами при X. Для оптимизации параметров использовался алгоритм градиентного спуска с функцией:

Таблица 2. Аллельный дисбаланс и микросателлитная нестабильность в хромофобной карциноме и онкоцитоме почки

^TR-мдпі/рп	Хромофобные карциномы				Онкоцитомы
STR-маркер	5006	13579	7226	10763	5858	14912	22058
D1S3465	MSI	NI	AI	N	NI	NI	N
D1S2142	MSI	N	AI	MSI	N	N	N
D2S1782	N	NI	AI	N	NI	N	N
D2S1336	NI	NI	NI	NI	NI	NI	NI
GAAT3A06	MSI	N	NI	N	N	N	N
D10S2469	AI, MSI	N	AI	N	N	N	N
D10S1216	NI	NI	NI	NI	NI	NI	NI
D13S634	MSI	AI, MSI	AI	N	N	N	N
D13S742	AI	N	AI	N	N	N	NI
D17S1298	MSI	N	AI	N	NI	NI	N
D21S11	AI, MSI	MSI	AI	AI	N	N	N
D21S1411	AI, MSI	N	AI	N	N	N	N

Примечание: сверху указаны номера блоков с материалом опухолей, курсивом выделены неинформативные STR-маркеры, полужирным шрифтом – минимальный набор локусов для алгоритма дифференциальной диагностики; NI (non-informative) – неинформативные случаи, AI (allelic imbalance) – аллельный дисбаланс, MSI (microsatellite instability) – микросателлитная нестабильность.

где m – число пациентов в обучающей выборке; y(i) – тип опухоли для пациента i (1 в случае хромофобной карциномы и 0 - онкоцитомы); hθ(x(i)) – предсказанное значение типа опухоли (от 0 до 1) для пациента i по его переменным x. Точность при сформированной обучающей выборке составила 92%. В результате был сформирован алгоритм, который использует в качестве входных данных матрицу значений аллельного дисбаланса и микросателлит-ной нестабильности для панели STR-маркеров, затем осуществляет подгонку введенных данных к логистической кривой и на выходе дает ряд значений вектора θ, однозначно задающих логистическую функцию для вероятностной дифференциальной диагностики хромофобной карциномы и онкоцитомы. Однако 7 STR-маркеров представляют собой необходимый и достаточный набор локусов для обучающей выборки, тогда как целесообразно в дальнейшем апробировать этот алгоритм на тестовой выборке большего объема, при этом включая в анализ все локусы, показавшие аллельный дисба- ланс и/или микросателлитную нестабильность при высокой гетерозиготности, т.е. 10 STR-маркеров из 12 первоначально выбранных для настоящего исследования (табл. 2). В нашей работе доброкачественные опухоли – онкоцитомы – не показали наличие аберраций по тестируемым локусам, как и образцы нормальной почечной паренхимы. Это отчасти не согласуется с данными высокоразрешающих методов анализа хромосомных аберраций на микрочипах, хотя подтверждается методами молекулярной цитогенетики (FISH на интерфазных и мета-фазных хромосомах) [7, 17]. Вместе с тем, имеются данные о том, что некоторые онкоцитомы имеют потерю гетерозиготности или амплификацию по хромосомам 1, Х и Y, а также транслокации с вовлечением хромосом 6, 9 и 11 [18]. Возможно, целенаправленное тестирование этих нарушений позволит сформировать паттерн аберраций, который позволит дифференцировать онкоцитому не только от хромофобной карциномы, но и от других типов опухолей почки.

В настоящей работе проведены ПЦР и последующее секвенирование экзонов 15-21 гена МЕТ, кодирующих тирозинкиназный домен рецептора HGF, с целью определения мутаций, которые характерны для папиллярной карциномы почки I типа. В одном образце опухоли смешанного строения (I/II типов) выявлена соматическая мутация c.3743A→G, приводящая к замене аминокислоты p.Y1248C и охарактеризованная в базе данных HGMD как активирующая миссенс-мутация при наследственной папиллярной карциноме I типа (rs121913246). Другие обнаруженные однонуклеотидные замены представляли собой известные синонимичные SNP в 20 и 21 экзонах: c.3912С→Т (rs41736), c.4026C→T (rs201519623), c.4071G→A (rs2023748) и c.4146G→A (rs41737). Таким образом, мутации МЕТ редко встречаются в спорадических папиллярных карциномах и не могут быть использованы в качестве маркера дифференциальной диагностики, даже если со временем будут накоплены данные, подтверждающие их □

Рис. 2. Секвенирование однонуклеотидных замен МЕТ в папиллярной карциноме Обозначения: стрелками указаны позиции однонуклеотидных замен, А – полиморфизм c.4071G→A,   Б – миссенс-мутация c.3743A→G (p.Y1248C).

специфичность для папиллярного РП I типа. Приблизительная оценка частоты мутаций на уровне 8% (1/13) в нашей работе близка к данным других авторов, обнаружившим мутации МЕТ в 12% папиллярных карцином почки [12]. Ранее показано, что определенный тип опухоли, развивающейся при моно-генном наследственном онкологическом синдроме и имеющей герминальные мутации в соответствующем гене-кандидате, часто не имеет или характеризуется низкой частотой аналогичных соматических мутаций в идентичных спорадических новообразованиях. В нарушении экспрессии МЕТ и/или связанного с ним сигнального пути могут играть роль другие механизмы (регуляция на уровне транскрипции или трансляции, эпигенетические факторы, отношение скоростей синтеза и деградации белка и т.п.). Несмотря на низкую частоту соматических мутаций, гиперэкспрессию МЕТ наблюдают в 90% папиллярных карцином почки [19]. Похожая ситуация встречается и в регуляции экспрессии других онкогенов, например, активация HRAS в результате соматических мутаций показана в 10% случаев рака мочевого пузыря, однако гиперэкспрессия белка HRAS происходит значительно чаще, что свидетельствует о наличии других механизмов активации гена [2]. Относительно редко наблюдают иную картину, как, например, в случае светлоклеточной карциномы почки: герминальные точковые мутации VHL являются причиной синдрома Хиппеля-Лин-дау (наследственный светлоклеточный РП), соматические точковые мутации VHL встречаются в 50-70% спорадических светлоклеточных карцином почки и специфичны для этого типа РП [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патоморфологическое исследование зачастую сталкивается с трудностями в определении хромофобной карциномы и онкоцитомы почки, так как эти опухоли имеют общее происхождение и сходство на гистологическом уровне. Однако хромофобная карцинома – злокачественная, а онкоцитома – доброкачественная опухоль, что обуславливает различный прогноз заболевания. Нами проведен поиск STR-маркеров и комплексный молекулярно-генетический анализ аллельного дисбаланса участков хромосом 1, 2, 6, 10, 13q, 17 и 21q в 4 хромофобных карциномах и 3 онкоцитомах. Показано, что аллельный дисбаланс и/или микросателлитная нестабильность по 2 и более из 12 выбранных локусов встречаются во всех хромофобных карциномах, тогда как в онкоцитомах отсутствуют нарушения в тестируемых STR-маркерах (р = 0.029 при α = 0.05). Разработку критерия дифференциальной диагностики хромофобной карциномы и онкоцитомы осуществляли методом классификационного анализа с обучением, основанном на модели логистической регрессии с регуляризацией. Точность критерия при сформированной обучающей выборке составила более 90%, что позволяет достоверно выявлять паттерн нарушений, характерный для хромофобной карциномы. Соматические мутации гена МЕТ, напротив, не могут служить диагностическим маркером папиллярного рака почки I типа вследствие низкой частоты встречаемости. Таким образом, предложена система из 10 STR-маркеров для дифференциальной диагностики хромофобной карциномы и онкоцитомы почки с помощью молекулярно-генетического анализа образцов первичной опухоли.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 12-04-31005 мол_а. □

Резюме: