Молекулярно-генетический анализ генов ACTN3 и AMPD1 у дзюдоистов спортивной школы по самбо и дзюдо "Витязь" г. Перми

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 575.22:577.29                                  

Изучение генетической предрасположенности у спортсменов является важным компонентом для прогноза развития их физических качеств и корректировки тренировочного процесса. В высокой конкурентной борьбе побеждать могут только те спортсмены, которые наиболее предрасположены к специфическим особенностям конкретного вида спортивной деятельности [1]. Выявлено около 140 генов, полиморфизмы которых влияют на формирование физических качеств спортсменов [2]. К генам, ассоциированным с физическими качествами «скорость/сила», относятся гены ACTN3 и AMPD1 .

Ген ACTN3 — ген скелетных мышц человека изоформы альфа-актинин-3 ( α-actinin-3 ) локализован в длинном плече 11 хромосомы (11q13-q14). Среди нуклеотидных замен гена ACTN3 наиболее известна замена C→T в локусе [3], которая приводит к терминации синтеза белка в аминокислотной позиции 577 экзона 16, что происходит вследствие замены аргинина на терминирующий кодон (замены R577X). Замена такого типа приводит к дефицитной нехватке α-актинина-3 в быстро сокращающихся мышечных волокнах, что может стать причиной снижения скоростно-силовых показателей физической работоспособности человека [4]. Частота аллеля 577X понижена у спортсменов, занимающихся скоростносиловыми видами спорта. Кроме того, у носителей неблагоприятного генотипа Х/Х велик риск развития мышечной гипертрофии [5].

Ген AMPD1 (adenosine monophosphate deaminase 1) локализован в локусе 1р13.1, контролирует синтез специфического скелетно-мышечного фермента аденозинмонофосфатдезаминазы, который повышает эффективность синтеза АТФ и играет ключевую роль в регуляции энергетических процессов в скелетной мускулатуре. Аденозинмонофосфатдезаминаза мышечной изоформы на 95% сконцентрирована в быстрых мышечных волокнах II типа. Причиной недостатка АМФ-дезаминазы является замена цитозина на тимин в 34 нуклеотиде кодирующей последовательности (С34T), в результате чего глютаминовый кодон превращается в стоп-кодон. У гомозигот по аллелю С активность АМФ-дезаминазы составляет 1% от таковой у гомозигот Т/Т [6]. Индивидуумы, имеющие пониженную активность фермента, испытывают слабость, быструю утомляемость или мышечные судороги даже после средней по интенсивности физической нагрузки [5].

Хорошо изучены аллельные варианты генов у единоборцев, таких как самбисты [7–8] и каратисты [9]. Имеются лишь единичные данные о полиморфизме генов у дзюдоистов [1]. Дзюдо, как и все единоборства, относится к ациклическим видам спорта. В отличие от бокса, карате и других ударных стилей единоборств, основой дзюдо являются броски, болевые приемы, удержания и удушения [10]. Подавляющее число действий в борьбе дзюдо носит скоростно-силовой характер.

Цель изучения — определить аллельные варианты генов ACTN3 и AMPD1 , ассоциированных со скоростно–силовыми качествами у спортсменов, занимающихся дзюдо.

Материал и методика

Выборка для исследований включала 71 дзюдоиста, обучающихся в Муниципальном бюджетном учреждении «Спортивная школа олимпийского резерва по самбо и дзюдо «Витязь» имени И. И. Пономарева» г. Перми. Среди обследованных спортсменов были 15 девушек и 56 юношей. Установлено [11], что полиморфизм избранных для изучения генов, не сцеплен с полом. Возраст испытуемых варьировал от 7 до 26 лет. Среди обследованных дзюдоистов были 2 мастера спорта, 1 кандидат в мастера спорта, 2 спортсмена со II и III взрослыми разрядами, 20 человек с первым юношеским разрядом, 29 человек со вторым юношеским разрядом и 17 человек, имеющих третий юношеский разряд.

В соответствии со спортивным разрядом на основании рекомендаций А. А. Скорина [1] 54 дзюдоиста были распределены на 2 группы спортивной успешности: «Группа I» с высокой квалификацией и «Группа II» с низкой квалификацией. Первая «Группа I» общей численностью в 25 спортсменов с высокой квалификацией включала: двух мастеров спорта (МС), 1 кандидата в мастера спорта (КМС), 2 спортсмена со 2-м и 3-м взрослыми разрядами, 20 человек с первым юношеским разрядом. Среди испытуемых этой группы 18 юношей и 7 девушек, в возрасте от 8 до 26 лет. Вторая «Группа II» с низкой квалификацией включала в себя 29 дзюдоистов со II юношеским разрядом. Среди испытуемых второй группы 24 юноши и 5 девушек, в возрасте от 7 до 14 лет. В соответствии с рекомендацией А. А. Скорина [1] при наличии спортсменов, не относящихся ни к одной из групп, они не учитываются при распределении по группам. В данном случае не учитывались 17 спортсменов с III юношеским разрядом. Материалом для молекулярно-генетического анализа являлись пробы буккального эпителия спортсменов. Все испытуемые были предупреждены об условиях эксперимента, и они или родители несовершеннолетних дали письменное согласие на добровольное участие в нем по типовой форме.

Забор биологического материала для генетического анализа проводили с помощью соскоба эпителиальных клеток ротовой полости одноразовыми цитологическими щетками перед тренировкой. Выделение ДНК проводилось сорбентным методом с помощью набора «Проба ГС», изготовленного компанией ООО «ДНК-Технология» (Россия) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Для проведения молекулярно-генетического анализа была выделена 71 проба ДНК испытуемых. Концентрацию проб ДНК определяли с помощью спектрофотометра SpectrofotometrTM NanoDrop 2000 Thermo scientific, (USA). Для проведения ПЦР брали пробы ДНК с концентрацией 5 нг/мкл. Препараты ДНК имели соотношение экстинкций 260 нм/280 нм близкое к 1,8, то есть являлись пригодными для ПЦР. С использованием ПЦР был исследован полиморфизм двух генов, ассоциированных с

развитием физических качеств у спортсменов, занимающихся дзюдо: R577X гена ACTN3 ( alpha-actinin-3 ), C34T гена AMPD1 ( adenosine monophosphate deaminase 1 ). Последовательности праймеров для амплификации полиморфных локусов двух избранных для изучения генов взяты из литературных источников [12–13] и синтезированы в ООО «Синтол» (г. Москва). Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала: 1 единицу Taq-полимеразы ООО «Силекс М», (г. Москва), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР ООО «Силекс М», (г. Москва), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg²⁺, 0,25 мМ dNTP. К реакционной смеси добавляли 5 мкл ДНК индивидуально каждого спортсмена. Амплификация ДНК была проведена на термоциклере Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems (USA). В качестве отрицательного контроля (К^-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды.

Полиморфизм R577X гена ACTN3 [12] определяли, применяя для ПЦР следующую программу амплификации: предварительная денатурация 95 °С — 1 мин.; 35 циклов: 95 °С — 1 мин, 58 °C — 30 cек, 72 °C — 40 cек. В результате ПЦР получаются ампликоны различной длины. Для выявления полиморфизма R577X продукт ПЦР дополнительно инкубировали вместе с эндонуклеазой рестрикции BstNS I «НПО СибЭнзим» (Россия, Новосибирск). Наличие четырех фрагментов ДНК (85, 97, 108 и 205 п.н.) соответствовало гетерозиготе R/X, трех фрагментов ДНК (108, 97 и 90 п.н.) — гомозиготе X/X, двух фрагментов ДНК длиной 205 и 85 п.н. — генотипу R/R. Исследование полиморфных вариантов гена AMPD1 проводили с использованием ПЦР, применяя программу амплификации [12] предварительная денатурация при 95 °С — 5 мин.; 30 циклов амплификации: 95 ^оС — 20 cек, 56 °С — 20 сек, 72 °С — 75 сек; последний цикл элонгации 72 °С — 7 мин. Для разделения ампликоны инкубировали совместно с эндонуклеазой рестрикции для AMPD1 — BstDE I «НПО СибЭнзим» (Россия, Новосибирск). При наличии одного фрагмента ДНК (214 п.н.) определялась гомозигота C/C, одного фрагмента ДНК (191 п.н.) — гомозигота T/T, двух фрагментов ДНК длиной 214 и 191 п.н. — генотип C/T [13]. Продукты рестрикции полиморфных позиций двух анализируемых генов ACTN3 и AMPD1 фракционировали при помощи электрофореза в 2% агарозном геле с окраской бромистым этидием и фотографированием в системе гель-документации GelDoc XR “Bio-Rad”, (USA) в проходящем ультрафиолетовом свете. ПЦР и электрофорезы повторяли не менее трех раз. Определение длин фрагментов ДНК проводилось при помощи программы Quantity One 4.6.2 (Bio-Rad, USA) с использованием маркера молекулярной массы (50 bp DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», г. Москва).

Оценка генетической предрасположенности по качеству «скорость/сила» на основании полученного генного профиля дзюдоистов проводилась с помощью метода расчета «общего генетического балла» или ОГБ [14]. Общий генетический балл генного профиля, связанного с качеством «скорость/сила», рассчитывали по формуле: ОГБ скорость/сила = (100/4) × (ГБ ACTN3 + ГБ AMPD1 ). Для хранения и обработки результатов исследований была создана матрица данных в виде электронных таблиц MS Excel 2010.

Результаты и их обсуждение

При генотипировании 71 дзюдоиста установлено, что частота встречаемости аллелей R и X гена АСTN3 составила 0,55 и 0,45 соответственно (табл.). По результатам распределения частот полиморфных позиций R577X гена ACTN3 получены следующие данные: генотип R/R, при котором наблюдается высокая функциональная активность α-актина-3 [15], отмечен у 7 из 71 дзюдоистов, то есть с частотой 0,1. Генотип R/X, характеризующийся средней функциональной активностью α-актина-3, был обнаружен у 64 спортсменов с частотой 0,9.

Самый же неблагоприятный генотип X/X, при котором α-актин-3 заменяется на α-актин-2, что приводит к снижению скоростно–силовых показателей физической работоспособности человека, не был обнаружен в исследуемой выборке.

Анализ распределения генотипов в соответствии с группами классификации спортсменов показал следующие результаты. При определении полиморфизма R577X гена ACTN3 у дзюдоистов, установлено, что частота аллелей R и Х в Группе I спортсменов с высокой квалификацией составила 0,58 (аллель R) и 0,42 (аллель X), а в Группе II с низкими спортивными разрядами — 0,55 и 0,45 соответственно (табл.). Анализ частот аллелей у спортсменов первой группы по сравнению со второй группой, показал незначимые различия по частоте аллелей R (F оп 0,02<1,96 при p=0,05) и X (F оп 0,03<1,96 при p=0,05). Частота более благоприятного для развития и проявления скоростно-силовых качеств генотипа R/R в первой группе у спортсменов с высокими спортивными разрядами (Группа I) равнялась 0,16 (4 человека), гетерозиготы R/X — 0,84 (21 спортсмен). Менее благоприятный генотип X/X в этой группе не встретился. Во второй группе у спортсменов с низкими разрядами благоприятный генотип R/R был отмечен с частотой 0,1 (у 3 дзюдоистов). Гетерозиготный же генотип R/X встречался с частотой 0,9 (у 26 спортсменов). Менее благоприятный генотип X/X также не был определен. Анализ генотипов показал незначимые различия между группами с разной спортивной квалификацией по благоприятному генотипу R/R (F оп 0,29<1,96 при p=0,05) и по неблагоприятному генотипу R/X (F оп 0,03<1,96 при p=0,05) (Таблица).

Таблица.

ЧАСТОТЫ АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ ГЕНОВ ACTN3 и AMPD1 У ДЗЮДОИСТОВ ШКОЛЫ «Витязь» г. Перми (n=54)

Аллели / генотипы	Частоты аллелей / генотипов в группах спортивной квалификации (число спортсменов)	Частоты аллелей / генотипов на общую выборку в 54 чел. (число спортсменов)	F оп<> F st
	Группа I (25 чел.)    Группа II (29 чел.)
Ген ACTN3

R	0,58	0,55	0,55	0,02<1,96
X	0,42	0,45	0,45	0,03<1,96
R/R	0,16 (4)	0,1 (3)	0,1 (7)	0,29<1,96
R/X	0,84 (21)	0,9 (26)	0,9 (64)	0,03<1,96
X/X	0 (0)	0 (0)	0 (0)	—
Ген AMPD1
C	0,96	0,88	0,92	0,1<1,96
T	0,04	0,12	0,08	1,95<1,96
C/C	0,92 (23)	0,76 (22)	0,83 (59)	0,23<1,96
C/T	0,08 (2)	0,24 (7)	0,17 (12)	1,83<1,96
T/T	0 (0)	0 (0)	0 (0)	—

Примечание: R, X — аллели гена ACTN3 , R/R, R/X, X/X — генотипы гена ACTN3 ; C, T — аллели гена AMPD1 ; C/C, C/T, T/T — генотипы гена AMPD1 ; Группа I — спортсмены с высокими спортивными разрядами (КМС, МС, 2 и 3 взрослый, 1 юношеский); Группа II — спортсмены с низким спортивным разрядом (2 юношеский разряд); F оп — F-критерий Фишера. F st — критерий Фишера стандартный равен 1,96 (при p=0,05); число спортсменов указано только у генотипов.

Частота встречаемости аллелей C и T гена AMPD1 у 71 спортсмена составила 0,92 и 0,08 соответственно (Таблица). В результате анализа распределения генотипов гена AMPD1 был выявлен генотип C/C у 59 человек из 71 обследованных, то есть c частотой 0,83. Генотип C/T наблюдался у 12 дзюдоистов, то есть в общей выборке с частотой 0,17. У спортсменов с этим генотипом каталитическая активность АМФ-дезаминазы 1 снижена. Генотип T/T не был обнаружен в общей выборке. Анализ полиморфной позиции С34Т гена AMPD1 у 25 спортсменов Группы I с высокой квалификацией, выявил высокую частоту (0,96) благоприятного аллеля C и низкую частоту (0,04) неблагоприятного аллеля T. В группе спортсменов с низкой квалификацией (Группа II) у 29 дзюдоистов частота аллеля С составила (0,88), соответственно, частота аллеля T (0,12) (Таблица).

Анализ частот аллелей показал незначимые различия между группами спортсменов с разными разрядами при анализе частот аллеля C (F оп 0,1<1,96 при p=0,05) и аллеля T (F оп 1,95<1,96 при p=0,05). Частота благоприятного для проявления скоростно-силовых качеств генотипа C/C у спортсменов первой группы (Группа I), составила 0,92 (23 спортсмена), гетерозиготы С/T — 0,08 (2 дзюдоиста), а менее благоприятного генотипа T/T в первой группе не оказалось. Вместе с тем частота благоприятного генотипа C/C во второй группе (Группа II) снизилась незначительно до 0,76 (22 человека), и, напротив, увеличилась частота гетерозиготного генотипа C/T до 0,24 (7 дзюдоистов). Генотипа T/T также не оказалось и во второй группе. При сравнении частот генотипов между группами дзюдоистов с разной квалификацией не обнаружено значимых различий (F оп 0,23<1,96 при p=0,05 по благоприятному генотипу C/C и F оп 1,83<1,96 при p=0,05 по менее благоприятному генотипу C/T).

У обследованных 71 дзюдоиста определен общий генетический балл (ОГБ). Для оценки качества «скорость/сила» использовали индивидуальные профили следующих полиморфизмов с присвоением их вариантов баллов (0, 1, 2):

• 1.    ACTN3 R577X полиморфизм: R/R = 2, R/X = 1, X/X = 0.

• 2.    AMPD1 C34T полиморфизм: C/C = 2, C/T = 1, T/T = 0.

Полигенные профили диапазона ОГБ, связанного с качеством «скорость/сила», у 71 дзюдоиста варьировали от 50 до 100 баллов. Наивысший показатель (100 баллов) отмечен у 5 человек (частота 0,07). Высокий результат (ОГБ=75 баллов) выявлен у 56 дзюдоистов (частота 0,79). Средний показатель предрасположенности к развитию скоростно–силовых качеств (ОГБ=50 баллов) определен у 10 спортсменов (частота 0,14). Низкий ОГБ (25 баллов) и самый низкий ОГБ (0 баллов) не был выявлен ни у одного из дзюдоистов исследуемой выборки. На основании проведенного молекулярно-генетического анализа полиморфных вариантов генов, ассоциированных с физическими качествами у спортсменов, занимающихся дзюдо и подсчета ОГБ, для каждого спортсмена были составлены Индивидуальные отчеты по генотипированию, которые были переданы спортсменам и их тренерам.

Выводы

В исследованной выборке дзюдоистов преобладает с частотой 0,9 гетерозиготный генотип R/X гена ACTN3 , носители которого характеризуются средней функциональной активностью α-актина-3. Наиболее благоприятный гомозиготный генотип R/R, при котором наблюдается высокая функциональная активность α-актина-3, встречается значительно реже

— с частотой 0,1. Гомозиготный же генотип X/X в выборке не обнаружен. Также в данной выборке преобладает наиболее благоприятный генотип C/C гена AMPD1, с частотой 0,83. У носителя данного генотипа не нарушена каталитическая активность АМФ-дезаминазы 1. Гетерозиготный генотип C/T встречается с частотой 0,17, а самый неблагоприятный гомозиготный генотип T/T не был обнаружен в общей выборке. Комплексный анализ результатов исследований показал, что высокой спортивной успешности имеют возможность достичь дзюдоисты со следующими генотипами: R/R гена ACTN3 , C/C гена AMPD1 . Эти генотипы могут быть использованы для определения развития физических качеств, например, при выборе спортивной специализации или для регулирования нагрузок в процессе тренировок.

Анализ полиморфизма двух генов ACTN3 и AMPD1 , ассоциированных со скоростносиловыми качествами, не выявил достоверно значимые различия частот между первой (Группа I — высокой квалификацией) и второй (Группа II — с низкой квалификацией) группами дзюдоистов. Полученные данные свидетельствует о том, что в процессе отбора отсеиваются спортсмены с неблагоприятными генотипами по многим причинам, одной из которых является их генетически обусловленная низкая работоспособность, выявляемая, в том числе и аллельными вариантами их генотипов по полиморфным локусам изученных двух генов. Таким образом, полученные результаты исследования показали, что изучение генетического профиля позволяет выявить перспективных спортсменов, положительно реагирующих на физические нагрузки, в отличие от спортсменов, для которых такие нагрузки нежелательны. Для спортсменов с высоким ОГБ — от 75 до 100 баллов по физическому качеству «скорость/сила», определенному на основании полиморфизма только двух генов, возможны интенсивные нагрузки на тренировках.

Спортсменам со средним ОГБ (50 баллов) по физическому качеству «скорость/сила», определенному на основании полиморфизма только двух генов, приемлема нагрузка умеренной интенсивности. Наличие благоприятных генотипов необходимо учитывать наряду с другими факторами [16], влияющими на достижения единоборцев в спортивной карьере. Помимо генотипов в достижении высоких спортивных результатов большую роль играют и другие качества, например, такие как морфометрия, физиологическое состояние организма и воля к победе.

Выражаем благодарность за консультации магистранту 1 курса кафедры ботаники и генетики А. В. Вороно. Искренне благодарю за представленную возможность и помощь в организации взятия проб тренеров и спортсменов из школы МБУ «Спортивная школа олимпийского резерва по самбо и дзюдо «Витязь» имени И. И. Пономарева» г. Перми. Отдельную благодарность — директору школы, мастеру спорта по самбо, многократному чемпиону России, Европы и Мира по дзюдо среди мастеров, подполковнику милиции в отставке А. В. Капустину, заместителю директора, начальнику отдела управления школой, подполковнику милиции в отставке В. В. Колесову, а также заслуженному тренеру России по дзюдо, мастеру спорта СССР, судье международной категории экстра класса по самбо Р. М. Закирову.