Молекулярно-генетический анализ популяций Pinus sylvestris L., обладающих смоляными кислотами с противомикробной активностью

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 575.174.015.3:582.475.2                         

В настоящее время остро стоит вопрос о новых антисептических средствах [1–2], включая и биологически активные вещества природного происхождения. Они максимально полно способны усвоиться организмом, не нагружая его балластными или токсическими соединениями и не вызывая аллергических реакций; хорошо переносятся людьми различных возрастных категорий, так как имеют минимум побочных действий и противопоказаний. Наиболее перспективными для выявления биологически активных соединений являются ранее не изученные смоляные кислоты хвойных видов растений [3]. Поиск биологически активных соединений необходимо проводить в разных отделах растений, в которых нужно сравнить видовое и генетическое разнообразие таксонов, а также биологическую активность природных соединений видов, входящих в различные таксоны. Основным естественным источником получения смоляных кислот являются хвойные породы деревьев семейства Pinaceae , которые по количественному и качественному составу терпеновых соединений значительно превосходят все другие виды растений [4–6].

Терпеноиды (изопреноиды), являющиеся одним из самых крупных классов природных соединений, стремительно приобретают статус перспективных лекарственных средств. У терпеноидов выявлено большое разнообразие терапевтических свойств — противоопухолевых, антимикробных, противопаразитарных, спазмолитических, противовоспалительных, иммуномодулирующих, антиаллергических [7–9].

К терпеноидам относится абсцизовая кислота, которая является гормоном растений. Впервые она была обнаружена в экспериментах по поиску вещества по способности вызывать опадение листьев и коробочек хлопчатника. Первые препараты абсцизовой кислоты (АБК) были независимо выделены в 1963 г. из листьев березы Ф. Эддикоттом и Ф. Уорингом с сотрудниками [10].

Роль генетического разнообразия в синтезе смоляных кислот у сосны обыкновенной, обладающей абсцизовой кислотой с противомикробной активностью, на популяционном уровне в Пермском крае ранее не изучалась.

Материал и методы

В качестве объекта исследования являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. ( Pinaceae ), расположенных в лесничествах: Гаинском (GN), Карагайском (KR), Пермском (UK) и Большесосновском (BS).

Для проведения исследований собраны образцы древесины 115 деревьев в четырех популяциях P. sylvestris . Выборки располагались на расстоянии не менее 80 км друг от друга, в каждой был взят материал с деревьев, расположенных друг от друга на расстоянии не менее 100 метров. Выделение ДНК из древесины проводили по методике Кота-Санчез [11].

Для молекулярно-генетического анализа был использован ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)-метод анализа полиморфизма ДНК [12]. Для ПЦР использованы пять наиболее информативных ISSR-праймеров: ISSR-1, CR-212, -215, M27, X10, показавшие наибольшую эффективность с ДНК сосны обыкновенной [13]. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) по типичной для ISSR-метода программе [14]: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94 °С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С,

5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 °С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64 °С.

В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2% агарозном геле, которые окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp+1,5+3Кb DNA Ladde; «ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы QuantityOne в системе гель-документации GelDoc XR (Bio-Rad, USA). Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров опыт повторяли не менее трех раз.

Компьютерный анализ полученных данных проведен с помощью программы POPGENE 1.31 [15] и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 [16] для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов ( P 95 ) [17], абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( n e ) [18], ожидаемой гетерозиготности ( H E ) [19].

Достоверность различий между показателями генетической изменчивости рассчитывалась по критерию Стьюдента, а для Р (доля полиморфных локусов) и Н _Е (ожидаемая гетерозиготность) применяли критерий Стьюдента с преобразованием Фишера. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов (STATISTICA10).

Результаты исследований

При молекулярно-генетическом анализе P. sylvestris выявлено 74 ISSR-PCR маркера, из которых 67 были полиморфными ( P 95 = 0,905). Доля полиморфных локусов выше в популяции GN ( P 95 =0,842), а ниже — в KR ( P 95 =0,679). Число ISSR-PCR маркеров P. sylvestris варьировало в зависимости от праймера: от 13 (праймеры CR-212 и M27) до 19 (праймер CR-215), а их размеры — от 200 до 1550 п. н.

Число полиморфных маркеров в общей выборке P. sylvestris варьировало от 12 до 18, а доля полиморфных локусов в зависимости от ISSR-PCR праймера колебалась от 0,867 до 0,947 (Таблица 1).

Таблица 1.

ХАРАКТЕРИСТИКА ISSR-PCR МАРКЕРОВ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ

P. sylvestris В ПЕРМСКОМ КРАЕ

Нукле отидная    Длина ISSR- последо-   фрагмен- прай-ватель-      тов, меры ность       пн (5'→ 3')	Число и частота полиморфных ISSR-PCR      На общую маркеров в популяциях                выборку GN     KR      UK      BS      P     N
ISSR-1    (АС) 8 T    220–1350 CR-212  (CT) 8 TG   230–1044 CR-215  (CA) 6 GT   200–1150 M27    (GA) 8 C    200–910 X10    (AGC) 6 C   200–1550	9(0,643)    5(0,500)    6(0,750)    6(0,750)   12(0,857)     14 8(0,615)    6(0,667)    9(0,818)    9(0,818)   12(0,917)     13 14(0,737)   13(0,813)   11(0,846)   12(0,857)   18(0,947)     19 10(0,769)   8(0,800)    8 (0,889)   9 (0,818)   12(0,923)     13 7(0,778)    6(0,600)    7(0,778)    6(0,600)   13(0,867)     15
Всего (частота)	48(0,842)  38(0,679)  40(0,800)  42(0,778)  67(0,905)    74

Примечание: GN — Гаинская, KR — Карагайская, BS — Большесосновская, UK — Юго-Камская популяции P. sylvestris ; в скобках указана частота полиморфных фрагментов.

Наименьшая доля полиморфных локусов ( P 95 =0,679) отмечена в популяции KR , а наибольшая ( P 95 =0,842) — в GN. Значения данного показателя различаются недостоверно, так как критерий Стьюдента с преобразованием Фишера равен 1,072, что не превышает критический показатель F st = 1,96.

Для характеристики генетического разнообразия популяций важны уникальные (R), то есть встречающиеся только в одной выборке, маркеры. В изученных выборках P. sylvestris выявлено 12 уникальных ISSR-PCR маркеров, из которых в выборках GN, BS, UK выявлено по 1 уникальному ISSR-PCR маркеру, в выборке KR — 9 (Таблица 2).

Таблица 2.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ P. sylvestris

Выборка	H E	n a	n e	R
GN	0,212 (0,023)	1,662 (0,476)	1,358 (0,369)	1 (0,014)
KR	0,187 (0,022)	1,568 (0,499)	1,309 (0,348)	9 (0,122)
UK	0,173 (0,022)	1,568 (0,499)	1,282 (0,333)	1 (0,014)
BS	0,174 (0,021)	1,595 (0,494)	1,280 (0,326)	1 (0,014)

На общую выборку 0,187 (0,022)        1,905 (0,295)        1,402 (0,308)         12 (0,162)

Примечание: H E — ожидаемая гетерозиготность; n a — абсолютное число аллелей на локус; n e — эффективное число аллелей на локус (у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения); R — число редких фрагментов, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов.

Средняя ожидаемая гетерозиготность ( H E ) на общую выборку P. sylvestris составила 0,187. Этот показатель наибольший в выборке GN ( H E = 0,212), а наименьший ( H E =0,173) — в выборке UK (Таблица 2). Значения данного показателя генетического разнообразия популяций GN и UK сосны обыкновенной при значении критерия Стьюдента с преобразованием Фишера, равным 0,366, незначимы.

Абсолютное число аллелей ( n a ) в общей выборке равно 1,905, а эффективное число аллелей ( n e ) — 1,402. Максимальный показатель ( n a =1,662) отмечен в популяции GN , а минимальный ( n a = 1,568) — в KR. Наибольшее значение эффективных аллелей ( n e ) выявлено в популяции GN и составило 1,358, а наименьшее — в BS и оказалось равным 1,280. Различия между значениями данных параметров генетического разнообразия в популяциях GN и KR, а также GN и BS являются незначимыми, так как для n a критерий Стъюдента составил 0,14, а для n e — 0,16, что не превышает t st = 1,96.

Все вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что популяция GN , расположенная в Гаинском лесничестве на севере Пермского края, характеризуется более высоким уровнем генетического разнообразия в сравнении с другими изученными популяциями ( P 95 = 0,842; H E = 0,212; n e = 1,358; R = 1). А доля полиморфных локусов в GN ( P 95 = 0,842), так же наибольшая.

В работе А. И. Видякина с соавторами [20] проведен анализ полиморфизма сосны обыкновенной из Северодвинской, Верхневетлужской и Ветлужско-Вятской популяций востока Восточно-Европейской равнины, которая граничит со Средним Уралом. В изученных трех популяциях P. sylvestris , расположенных на равнине, в результате ПЦР выявлено 114 ISSR-PCR маркеров, а в исследованиях в природных популяциях в Китае Ли Хуэйюй с соавторами было выявлено 108 ISSR-PCR маркеров [21]. Доля полиморфных локусов ( P 95 ) в общей выборке популяций с Восточно-Европейской равнины России незначительно выше, чем в изученных популяциях Пермского края, и составила 0,956 [20],

Таким образом, при сравнении с литературными данными, такие показатели генетического разнообразия изученных популяций сосны обыкновенной Пермского края как доля полиморфных локусов и абсолютное число аллелей высоки ( P 95 = 0,905; n a = 1,905), ожидаемая гетерозиготность и эффективное число аллелей имеют средние для вида значения ( H E = 0,187; n e = 1,402).

Содержание смоляных кислот у сосны обыкновенной в разных регионах Евразии зависит от ряда причин. Полученные данные позволят в дальнейшем выявить роль генетического разнообразия сосны обыкновенной на популяционном уровне в синтезе абсцизовой кислоты, обладающей противомикробной активностью.

Работа выполнена в рамках государственного задания №FSNF-2020-0008 ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» по науке 2020 года