Молекулярно-генетический анализ редкого вида растения Pulsatilla patens (L.) Mill. Северного Казахстана

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 575.22:577.29                                  

Pulsatilla patens (L.) Mill. — прострел раскрытый относят к редким видам растений. Занесен в Красную книгу Казахстана [1]. В последние 50 лет наблюдается сокращение численности этого вида. Это связано со многими факторами, среди которых основной вклад вносит человек. Выпас скота, сбор цветов из-за декоративных и лечебных свойств и другая деятельность человека. А также снижение численности происходит из-за уменьшения количества насекомых-опылителей и неблагоприятных погодных условий, таких как продолжительные и морозные зимы [2]. Молекулярно–генетические исследования данного вида имеют особую важность для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия — отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению [3]. Для анализа генетического полиморфизма у Pulsatilla patens (L.) Mill. был применен метод межмикросателлитного анализа (ISSR — Inter Simple Sequence Repeats). Это связано с рядом его особенностей: не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагмента для подбора праймеров, маркеры доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию или отсутствию полосы, имеет высокую точность, улучшенную воспроизводимость из-за длины праймера (15–24 нуклеотида) и более высокую температуру отжига. Поэтому может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования [4]. Легкость применения этого типа маркеров, универсальность праймеров, возможность вовлечения в анализ одновременного большого числа локусов делает их весьма перспективными для массового популяционного анализа [5].

Цель данной работы — молекулярно–генетический анализ 5 ценопопуляций редкого вида растения Pulsatilla patens (L.) Mill. Северного Казахстана.

Материал и методы исследования

Материалом для выделения ДНК служили листья 150 гербарных образцов 5 ценопопуляций Pulsatilla patens (L.) Mill. Павлодарской, Акмолинской, Костанайской областей Северного Казахстана (Таблица 1).

Таблица 1.

ИССЛЕДОВАННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ Р.patens (L.) Mill.

Обозначение популяции	Место сбора
Pp1	Павлодарская обл., окр. c. Баянаул, горы Баянаул, поляна между гранитных скал
Pp2	Акмолинская обл., окр. с. Ерейментау, горы Ерейментау, основание сопки
Pp3	Акмолинская обл., Бурабайский район, окр. с. Акылбай, ГУ Государственный национальный природный парк «Бурабай», Боровское лесничество, кв.96, ковыльноразнотравная степь на восточном склоне сопки
Pp4	Костанайская обл., Мендыгаринский район, окр. с. Каменск-Уральск
Pp5	Костанайская обл., Мендыгаринский район, окр. с. Боровское, 80 км по трассе Костанай–Боровское

Для выделения ДНК была использована модифицированная методика С. Роджерса с использованием поливинилполипирролидона (PVPP) в качестве сорбента [6]. Навеска растительного материала для выделения ДНК составляла 20 мг листьев. После выделения в полученных пробах измерялась концентрация ДНК, степень их чистоты на спектрофотометре SpectrofotometrTM NanoDrop 2000 (Thermo scientific, США).

Выявление генетического полиморфизма ДНК P. patens проводили ISSR-методом анализа полиморфизма ДНК [4] с применением полимеразной цепной реакции. Амплификацию ДНК проводили с использованием 5 ISSR-праймеров (ISSR-1 (AC)8T, ISSR-3 (TG)8A, M1 (AC)8G, M27 (GA)8C, X11 (AGC)6G), высокая эффективность которых была установлена ранее [7]. Для ПЦР реакционная смесь содержала: 2 единицы Tag -полимеразы («Силекс М», Россия); 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Евроген», Россия); 2,5 мМ MgCl 2 («Силекс М», Россия); 0,25 мM dNTP (Fermentas, Литва); 5 мкл ДНК с концентрацией 10 нг/мкл. Амплификацию проводили в термоциклере MJ Mini-Cycler (Bio-Rad, США) по следующей программе для ISSR-анализа:

предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94 °С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 °С, 10 сек; в последующих тридцати пяти циклах 94 °С, 5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 °С. Температура отжига варьировала от 52 до 64 °С в зависимости от G/C состава ISSR-праймеров.

Для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды в реакционную смесь в качестве отрицательного контроля (К-). Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1×ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Определение длин фрагментов ДНК проводилось при помощи программы Quantity One 4.6.2 (Bio-Rad, США) с использованием маркера молекулярной массы (100 bp DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», г. Москва).

Компьютерный анализ полученных данных осуществляли с помощью программ POPGENE 1.31 [8], Treecon 3.1 и с помощью специализированного макроса GenAlE×6 [9] для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов ( P 95 ) [10], абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( n e ), ожидаемой гетерозиготности ( H E ) [11], информационного индекса Шеннона ( I ) [12], среднего числа морф ( μ ), доли редких морф ( h ) [13] и числа редких фрагментов ( R ).

Результаты и их обсуждение

При анализе фрагментов ДНК амплифицированных в результате ПЦР в 5 изученных ценопопуляциях P..patens было выявлено 144 амплифицированных фрагмента ДНК, из которых 139 были ( P 95 =0,965) полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в суммарной выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 23 (М1) до 28 (М27). Число полиморфных фрагментов ДНК в суммарной выборке растений варьировало от 9 до 28, а их размеры — от 200 до 1420 пн.

Доля полиморфных локусов в общей выборке P..patens была высокой и в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,920 (М1) до 1,000 (М27, ISSR3), в среднем она составила 0,965. Число полиморфных фрагментов ДНК варьировало от 78 у Pp1 до 103 у Pp5. Доля полиморфных локусов ( P 95 ) в ценопопуляциях варьировала от 0,728 (Pp3) до 0,851 (Pp5) (Таблица 2).

Ожидаемая гетерозиготность ( H E ) по локусам в общей выборке P..patens составила 0,162. В ценопопуляциях P..patens эта величина варьировала от 0,131 в Pp1 до 0,209 в Pp5 (Таблица 2) . Разница между значениями показателей ожидаемой гетерозиготности и доли полиморфных фрагментов ДНК была не достоверной (Таблица 3).

Абсолютное число аллелей на локус ( n a ) на общую популяцию составило 1,965. Этот параметр наибольший в ценопопуляции Pp5 ( n a =1,743), а в ценопопуляции Pp1 он наименьший ( n a =1,597). Эффективное число аллелей на локус ( n e ) на общую выборку равно 1,361. Большее значение n е в ценопопуляции Pp5 ( n е =1,330), а наименьшее значение в популяции Pp1 ( n е =1,197). В изученных ценопопуляциях P..patens обнаружено всего 2 редких фрагмента ДНК: по одному в Pp1 и Pp2 (Таблица 2).

У всех изученных ценопопуляций P..patens показатель h имеет значения меньше 0,3. Наиболее сбалансированной структурой разнообразия характеризуется ценопопуляция Pp5 ( h =0,139), а наименее сбалансированной ( h =0,188) — ценопопуляция Pp4. Информационный Индекс Шеннона выявил наибольшее разнообразие в ценопопуляции Pp5 ( I =0,327), а наименьшее в — Pp1 ( I =0,215) (Таблица 2).

Таблица 2.

Ценопопуляции / показатели	Pp1	Pp2	Pp3	Pp4	Pp5	На общую выборку
Н Е	0,131 (0,013)	0,166 (0,013)	0,148 (0,013)	0,157 (0,014)	0,209 (0,014)	0,162 (0,013)
n a	1,597 (0,492)	1,715 (0,453)	1,660 (0,475)	1,632 (0,484)	1,743 (0,438)	1,965 (0,184)
ne	1,197 (0,266)	1,255 (0,296)	1,224 (0,280)	1,247 (0,311)	1,330 (0,317)	1,361 (0,306)
P 95	0,772	0,838	0,728	0,741	0,851	0,965
R	1	1	0	0	0	2
μ	1,634 (0,006)	1,668 (0,005)	1,629 (0,006)	1,625 (0,006)	1,723 (0,005)	1,656 (0,006)
h	0,183	0,166	0,185	0,188	0,139	0,172 (0,003)
	(0,003)	(0,003)	(0,003)	(0,003)	(0,002)
I	0,215	0,268	0,242	0,249	0,327	0,373 (0,196)
	(0,226)	(0,232)	(0,229)	(0,246)	(0,244)

Примечание: H E — ожидаемая гетерозиготность; _n — абсолютное число аллелей на локус; n e — эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R — редкие фрагменты; μ — среднее число морф; h — доля редких морф; I — информационный индекс Шеннона

Таблица 3.

Ценопопуляция	Pp1	Pp 2	Pp 3	Pp 4	Pp 5
Pp 1	—	0,647	0,394	0,280	0,786
Pp 2	0,382	—	1,041	0,927	0,139
Pp 3	0,190	0,192	—	0,141	1,461
Pp 4	0,287	0,095	0,097	—	1,066
Pp 5	0,809	0,427	0,619	0,522	—

Примечание: над диагональю значения достоверности разницы доли полиморфных локусов ( P 95 ), под диагональю ожидаемой гетерозиготности — ( H E ); при F опыт больше 1,96 результат достоверен

Анализ генетической структуры ценопопуляций P..patens показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей выборке ( H T ) P..patens составила 0,232, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H S ) в ценопопуляциях P..patens равна 0,162 (Таблица 4). Таким образом, ожидаемая доля гетерозиготных генотипов ( H S ) в ценопопуляциях P..patens ниже, чем в общей выборке.

В 2016 г было проведено исследование генетического разнообразия европейских популяций P. patens [2]. Всего изучено 29 популяций P..patens с использованием микросателлитных праймеров. Результаты исследования показывают, что проанализированные популяции характеризуются низкими показателями гетерозиготности (H o =0,005, H e =0,561) и очень высокими уровнями инбридинга (F IS =0,90). При этом результаты указывают на более высокий уровень изменчивости внутри популяций (77%), чем между популяциями (23%) [2]. Полученные нами данные с применением межмикросателлитного анализа генетического полиморфизма в 5 ценопопуляциях P..patens Северного Казахстана показывают еще более низкие значения ожидаемой гетерозиготности (H e =0,162), а подразделенность изученных ценопопуляций имеет схожие значения ( G ST =0,300).

Если сравнивать полученные показатели генетического разнообразия для ценопопуляций P..patens Северного Казахстана с показателями ценопопуляций P..patens Пермского края ( P 95 — 0,603; H E — 0,141; I — 0,230 ) [14], можно заметить, что ожидаемая гетерозиготность, доля полиморфных фрагментов ДНК и индекс разнообразия Шеннона выше у ценопопуляций Северного Казахстана.

Таблица 4.

ISSR-праймер	H T	H S	G ST
M1	0.149 (0,013)	0,121 (0,005)	0,185
ISSR1	0,256 (0,023)	0,181 (0,009)	0,292
X11	0,182 (0,019)	0,148 (0,012)	0,190
ISSR3	0,238 (0,025)	0,143 (0,009)	0,397
M27	0,324 (0,019)	0,219 (0,009)	0,326
На общую выборку	0,232 (0,023)	0,162 (0,010)	0,300

Примечание: H T — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; H S — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; G ST — доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

На основании полученных данных по ISSR-анализу полиморфизма ДНК P..patens были определены генетические взаимоотношения между исследуемыми ценопопуляциями, составлена матрица бинарных признаков и рассчитаны матрицы генетических различий. На основании полученной матрицы был проведен кластерный анализ невзвешенным парногрупповым методом (UPGMA) и построена дендрограмма, отражающая степень сходства исследуемых ценопопуляций P..patens по ISSR-спектрам (Рисунок).

Для построения дендрограммы использовали компьютерную программу Treecon 3.1 с применением 100 реплик бутстрепа. Наименьшее генетическое расстояние отмечено между ценопопуляциями P. patens Костанайской области Pp4 и Pp5 (D=0,087), а наибольшее — между ценопопуляциями, расположенными в Акмолинской области Pp2 и Pp3 (D=0,131) (Таблица 5).

0.5	0.4 1		0.3	0.2	0.1
	97	93 cz____	1	1	Pp 4
99		p
					p
					Pp 1

	Pp1	Pp 2	Pp 3	Pp 4	Pp 5
Pp 1	—
Pp 2	0,109	—
Pp 3	0,127	0,131	—
Pp 4	0,111	0,095	0,116	—
Pp 5	0,120	0,106	0,091	0,087	—

Выводы

На основании проведенного ISSR-анализа генетического полиморфизма пяти ценопопуляций Pulsatilla patens (L.) Mill. Cеверного Казахстана можно сделать вывод, что изученные ценопопуляции характеризуются довольно высокими показателями генетического разнообразия ( Р 95 =0,965, n e =1,361), за исключением показателей ожидаемой гетерозиготности ( H E =0,162).

В двух из пяти изученных ценопопуляций P. patens (L.) Mill. были обнаружены редкие фрагменты ДНК: у ценопопуляции из Павлодарской области и у ценопопуляции из Акмолинской области (с. Ерейментау) .

Пятая ценопопуляция из Костанайской области (с. Боровское) (Pp5) имеет самые высокие показатели генетического разнообразия ( P 95 =0,851, H E =0,209, I =0,327) по сравнению с другими ценопопуляциями этого вида, изученными на территории Северного Казахстана.

Работа выполнялась в рамках проекта грантового финансирования Министерства образования и науки Республики Казахстан на 2018-2020 гг. № AP05132458 «Молекулярногенетический анализ генофондов популяций редких видов растений Северного Казахстана», номер государственной регистрации 0118РК00404.