Молекулярно-генетический анализ самоопыленных линий кукурузы

На современном этапе неотъемлемой характеристикой селекционного материала является его генетический паспорт. Применение в селекционных работах, наряду с традиционными методами новых технологий молекулярно-генетического анализа, играет основную перспективную роль в оптимизации селекционных процессов. В частности, их применение даст возможность предпосевной лабораторной оценки исходного селекционного материала при формировании гибридных комбинаций, позволит значительно сократить время их подбора и, в конечном счете, создать генотипы с заданными свойствами [1].

Анализ и классификация огромного резерва изменчивости, выявляемого на уровне ДНК и обусловливающего генетическое разнообразие селекционного материала, является исключительно актуальным для селекции, так как часть этих нуклеотидных изменений, их комбинации в итоге определяют фенотипическую изменчивость [2].

Самым простым информативным методом анализа генетического разнообразия селекционного материала может служить RAPD-анализ. Он позволяет амплифицировать различные участки ДНК с неизвестной локализацией в геноме. Данный метод основан на использовании одного или более произвольных олигонуклеотидных праймеров, где функцию прямого и обратного праймеров выполняет один и тот же олигонуклеотид. В результате ПЦР с произвольными праймерами образуются спектр уникальных, часто полиморфных фрагментов геномной ДНК [3].

В связи с этим, возникает необходимость в систематизации этого материала, направленного на отбор наилучших из них. Тестирование линий требует проведения значительного объема работ, в связи с чем, желательно вовлекать в скрещивание только лучшие по агрономическим показателям и генетически разнообразные линии с прогнозированной их высокой ценностью. Скрещивание генетически близких линий является неэффективным путем поиска перспективных гибридных комбинаций. Выявить генетическую близость или отдаленность линий, основываясь только на данных морфологических признаков – проблематично. Наряду с традиционными оценками исходного материала кукурузы использование современных методов, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР) с произвольными праймерами, позволяет выявить различия даже между близкородственными линиями. Благодаря этому можно получать более надежную классификацию исходного материала. Анализ произвольно амплифицированой полиморфной ДНК (RAPD) позволит изучить генетическое разнообразие линий кукурузы. Кроме того, можно оптимизировать подбор линий для скрещивания и повысить эффективность традиционного селекционного процесса [4].

Цель работы: молекулярно-генетическое исследование самоопыленных линий кукурузы с помощью RAPD-метода.

Впервые был проведен молекулярно-генетический анализ линий кукурузы селекции кафедры общей генетики, селекции и семеноводства КБГУ и их родительского сорта Юбилейная-50 с получением уникальных спектров фрагментов ДНК RAPD-методом по каждому исследуемому образцу. Были установлены генетические дистанции между самоопыленными линиями кукурузы и сортом Юбилейная-50 [5,6].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В анализе были использованы самоопыление линии кукурузы, полученные с применением химических мутантов нитрозоэтилмоче- вины (НЭМ) и нетрозометилмочевины (НММ) в концентрациях 0,01 и 0,025%, под руководством профессоров К.Н.Керефова и М.К.Керефовой и их родительская форма – сорт Юбилейная-50. С целью установления чистоты линий при ручном опылении на молекулярном уровне семена линии 8 были взяты с початков двух разных рядов одной и той же линии 8 [7].

Ниже дается характеристика 8 линий, которые были использованы в нашей работе:

Линия 4. Линия среднеспелая, длина вегетационного периода в 128-135 дней. Растение высотой 200-210 см, высота прикрепления верхнего початка 100-108см. Устойчивость против полегания средняя. Початок массой 81-85г, длиной 10-15 см. Рядов зерен на початке 12-14, число зерен в ряду 25-28 штук. Зерно и стержень початка белые. Зерно зубовидное. Число початков с растения - 2,2.

Линия 6. Линия среднепоздняя, длина вегетационного периода в 130-145 дней. Растение высотой 100-108 см, высота прикрепления верхнего початка 35-40 см. Устойчивость против полегания средняя. Початок массой 82-85 г, длиной 10-15 см. Рядов зерен на початке 12-14, число зерен в ряду 23-25 штук. Зерно и стержень початка белые. Число початков с растения -1,9.

Линия 8. Линия среднеспелая, длина вегетационного периода в среднем 125-130 дней. Растение высотой 130-135 см, высота прикрепления верхнего початка 41-48 см. Устойчивость против полегания средняя. Початок массой 77-85 г, длиной 13-15 см. Рядов зерен на початке 14-16, число зерен в ряду 20-25 штук. Зерно и стержень початка белого цвета. Зерно зубовидное. Число початков с растения -1,9.

Линия 9. Растение высотой 260-270 см, высота прикрепления верхнего початка 93 – 100 см. Устойчивость против полегания средняя, средняя засухоустойчивость. Длина початка 11 – 13 см. Рядов зерен на початке 12, число зерен в ряду 20-23 штук. Длина метелки 33-38, количество боковых веточек 17. Количество листьев на стебле 10-12. Зерно белое кремнистое. Стержень початка белый. Число початков с растения – 1,8.

Линия 14. Линия среднеспелая, длина вегетационного периода колеблется в среднем 123128 дней. Растение высотой 208-212 см, высота прикрепления верхнего початка 92-98 см. Початок массой 86-88 г, длиной 16-18 см. Число рядов 10-12, число зерен в ряду 30-38 штук. Зерно и стержень початка белого цвета. Зерно кремнистое. Число початков с растения - 1,8.

Линия 20. Растение высотой 270-280 см, высота прикрепления верхнего початка 95 – 105

см. Устойчивость против полегания средняя, средняя засухоустойчивость. Длина початка 15 – 18 см. Рядов зерен на початке 10-12, число зерен в ряду 25-28 штук. Длина метелки 45-50, количество боковых веточек 19. Количество листьев на стебле 11-12. Зерно белое кремнистое. Стержень початка белый. Число початков с растения – 2,0.

Линия 28. Линия среднеспелая, длина вегетационного периода в среднем составляет около 130 дней. Растение высотой 205-210 см, длина прикрепления верхнего початка 96-98 см. Устойчивость против полегания средняя. Початок массой 85-90 г, длиной 15-19 см. Рядов зерен на початке 10-12, число зерен в ряду 28-30 штук. Зерно и стержень початка белого окраса. Зерно зубовидное. Число початков с растения – 1,8.

Линия 30. Линия среднеспелая, длина вегетационного периода в среднем составляет около 130 дней. Растение высотой 185-192 см, длина прикрепления верхнего початка 80-83 см. Устойчивость против полегания средняя. Початок массой 71-76 г, длиной 15-21 см. Число рядов 12-14, число зерен в ряду 25-30 штук. Зерно и стержень початка белого цвета. Зерно зубовидное. Число початков – 2,1.

Выделение ДНК проводилось двумя способами: 1) методом тризольного выделения с хло-роформаной очитской; 2) готовыми наборами для выделения ДНК из растительного материала «ДНК-сорб-С». ДНК выделяли из трех-, пятидневных проростков, пророщенных в лабораторных условиях. Семена перед проращиванием предварительно обрабатывали 70%-ным этанолом для исключения экзогенной микрофлоры.

Молекулярно-генетический анализ опытных самоопыленных линий кукурузы в работе проводился методом анализа полиморфизма амплифицированных неспецифическими праймерами фрагментов ДНК. В результате предварительного скрининга были выбраны 6 информативных RAPD-праймеров.

ПЦР проводилась в амплификаторе MyCyCler (Bio-Rad, США).

Объем реакционной смеси составлял 20 мкл.

В результате проведенной оптимизации были выбраны следующие условия амплификации. На начальном этапе проводилась денатурация ДНК при 940С, после чего следовали 25 – 30 циклов амплификации, каждый из которых включал стадию денатурации ДНК в течение 40 сек при 940С, стадию отжига праймеров продолжительностью 1мин 30 сек при температуре от 54 до 720С (в зависимости от длины и нуклеотидных последовательностей, использованных праймеров), и стадию элонгации в течение 1 мин 30 сек при температуре 720С, которая оптимальна для активности Taq-полимеразы. В некоторых случаях, для оптимизации ПЦР и уменьшения количества неспецифичных продуктов амплификации использовалась специальная процедура, получившая название «горячего старта». При этой процедуре добавление Taq-полимеразы, разбавленной в 10 мкл соответствующего 1-кратного буфера, в реакционную смесь осуществлялась только после нагрева последней до 940С, что исключало возможность неспецифичного отжига праймеров на нуклеотидных последовательностях с низкой гомологией. По завершению амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкл и анализировали в 1,5%-ном агарозном геле.

Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли в 1,5%-ном агарозном геле. Источником питания служили приборы модели 150/2.5 фирмы Bio-Rad (США).

Агарозный гель-электрофорез осуществлялся в приборах подводного типа MINI-CUB Cell GT (Bio-Rad, США). Толщина используемых в различных экспериментах гелей варьировала незначительно от 2 до 4 мм. Гребенки для формирования колодцев имели толщину 1,5 мм и отличались шириной зубчиков (от 3 мм до 8 мм). В лунки вносилось по 4 мкл ПЦР-продукта. В качестве буферной системы использовали ТАЕ-бу-фер, содержащий 40 мМ трис-ацетата (рН 7,6) и

• 2    мМ ЭДТА.

Опытным путем было установлено, что при электрофорезе оптимальными условиями является 50 V в течение 120 минут.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности RAPD-праймеров

№	Праймер	Нуклеотидная последовательность (5'-3')
1	ОPA01	CAGGCCCTTC
2	ОРА 02	TGCCGAGCTG
3	ОPA08	GTGACGTAGG
4	ОРН 07	CTGCATCGTG
5	ОРН 13	GACGCCACAC
6	ОPF 06	GGGAATTCGG

После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием (5 мкг/мл) в течение 10 мин. Флуорисценцию нуклеиновых кислот наблюдали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 302 нм в трансиллюминаторе UVP (BioDoc-ITTM, Imaging System). Нуклеиновые кислоты, окрашенные бромидом этидия светились оранжево-красным светом. В работе использовался маркер молекулярного веса Axygen Low Range DNA Marker.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На продуктивность амплификации, уровень свечения ампликонов, наличие артефактных зон на электрофореграмме в большой степени может оказывать влияние степень чистоты, выделенной ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси белков, липидов, и иных ингибиторов амплификации.

В связи с этим выделение ДНК осуществлялось двумя способами для того, чтобы установить возможное влияние метода выделения на количественный выход продуктов амплификации и, следовательно, на качество электрофореграмм при визуализации результатов ПЦР.

По результатам пробной амплификации была видна существенная разница в качестве электрофореграмм в зависимости от методы выделения. Наиболее четко ампликоны визуализируются при методе выделения готовыми наборами для выделения ДНК из растительного материала «ДНК-сорб-С». В дальнейшей работе использовались образцы ДНК, выделенные этим методом.

Молекулярно-генетический анализ само-опыленных линий кукурузы селекции КБГУ был проведен серией RAPD-праймеров. По результатам амплификации были отобраны 6 наиболее информативных праймера (OPA 01, OPA 02, OPA 08, OPH 07, OPH 13, OPF 06).

В RAPD анализ включены самоопыленные линии кукурузы и их родительская форма Юбилейная-50 для установления генетических дистанций между линиями и между линиями и родительской формой после обработки мутагенами и многолетнего самоопыления.

В анализ были включены образцы линии 8 с 9-го и 11-го ряда, разделенные на две подлинии по морфологическим характеристикам зерен, для подтверждения различий подлиний на генетическом уровне.

Ниже представлены результаты исследований в виде матрицы результатов амплификации по каждому праймеру на каждой линии и сорту

Таблица 2. RAPD-спектр линий кукурузы при использовании праймера ОРА 01

Название зоны	Номера образцов
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ОРА 01750	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 01500	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 01350	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 01300	0	0	0	0	1	1	1	1	0	0

Таблица 3. RAPD-спектр линий кукурузы при использовании праймера ОРА 02

Название зоны	Номера образцов
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ОРА 02 1600	1	0	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 02 1500	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 02 1000	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1
ОРА 02 600	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 02 300	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

Таблица 4. RAPD-спектр линий кукурузы при использовании праймера ОРА 08

Название зоны	Номера образцов
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ОРА 08 1000	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 08 500	0	0	0	0	0	1	1	1	1	0
ОРА 08 400	1	1	0	0	0	0	0	0	0	1
ОРА 08 250	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 08 125	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

Юбилейная-50. С каждой электрофореграммой идет, в которой наличие ампликона обозначается 1, его отсутствие – 0. Данные с матриц по каждому примеру были сведены в суммарную матрицу состояния бинарных признаков для построения дендрограммы, позволяющей выявить генетические дистанции между исследуемыми образцами. (Таблица 2. 1-Юбилейная-50; 2-линия 4; 3-линия 6; 4-линия 8 (9 ряд); 5-линия 8 (11 ряд); 6- маркер; 7- линия 9; 8- линия 14; 9- линия 20; 10- линия 28; 11- линия 30; 12- «-» контроль).

По локусам ОРА 01 750, ОРА 01 500, ОРА 01 350 ампликоны выявлены у всех исследуемых образцов.

По локусу ОРА 01 300 у Юбилейной-50, линий 4, 6, 8 (9), 28, 30 апликоны не выявлены. Ампликоны выявлены у линий 8 (11), 9, 14, 20.

Выявляется различие между подлиниями 8 (9) и 8 (11).

По локусам ОРА 02 1500, ОРА 02 600, ОРА 02 300 ампликоны выявлены у всех исследуемых образцов (Таблица 3. 1-Юбилейная-50; 2-линия 4; 3-линия 6; 4-линия 8 (9 ряд); 5-линия 8 (11 ряд); 6- линия 9; 7- линия 14; 8- линия 20; 9- линия 28; 10- линия 30; 11- маркер).

По локусу ОРА 02 1600 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 6, 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20, 28, 30. У линии 4 ампликон не выявлен.

По локусу ОРА 02 1000 ампликоны выявлены у линий 28 и 30. У линий Юбилейной-50, линий 4, 6, 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20 ампликоны не выявлены.

По локусам ОРА 08 1000, ОРА 08 250, ОРА 08 125 ампликоны выявлены у всех оразцов (Таблица4. 1- маркер; 2-Юбилейная-50; 3-линия 4; 4-линия 6; 5-линия 8 (9 ряд); 6-линия 8 (11 ряд); 7- линия 9; 8- линия 14; 9- линия 20; 10- линия 28; 11- линия 30; 12- «-» контроль).

По локусу ОРА 08 500 ампликоны выявлены у линий 9, 14, 20, 28. У Юбилейной-50, линий 4, 6, 8 (9), 8 (11), 30 ампликоны не выявлены.

По локусу ОРА 08 400 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 4 и 30. У линий 6, 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20, 28 ампликоны не выявлены.

По локусам ОРН 07 500, ОРН 07 350 ампликоны выявлены у всех образцов.

По локусу ОРН 07 750 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 4, 6, 8 (9 ряд), 14, 20, 30. У линий 8 (11), 9, 28 ампликоны не выявлены. Выявляются различия между подлиниями 8 (9) и 8 (11) (Таблица 5. 1- маркер; 2-Юбилейная-50; 3-линия 4; 4-линия 6; 5-линия 8 (9 ряд); 6-линия 8 (11 ряд); 7- линия 9; 8- линия 14; 9- линия 20; 10- линия 28; 11- линия 30; 12- «-» контроль).

По локусу ОРН 07 125 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 4 и 30. У линий 6, 8 (9 ряд), 8 (11), 9, 14, 20, 28 ампликоны не выявлены.

По локусам ОРH 13 600, ОРH 13 470, ОРH 13 300 ампликоны выявлены у всех образцов (Таблица 5. 1-Юбилейная-50; 2-линия 4; 3-линия 6; 4-линия 8 (9 ряд); 5-линия 8 (11 ряд); 6- линия 9; 7- линия 14; 8- линия 20; 9- линия 28; 10- линия 30; 11- маркер).

По локусу ОРH 13 2500 ампликон выявлен только у линии 28.

По локусу ОРH 13 1000 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 4, 6, 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20, 30. У линий 20 и 30 ампликоны не выявлены.

По локусу ОРH 13 750 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20.

По локусу ОРH 13 125 ампликон выявлен только у линий 30.

По локусам ОРF 06 350, ОРF 06 280 ампликоны выявлены у всех образцов.

По локусу ОРF 06 950 ампликон выявлен только у Юбилейной-50.

Таблица 5. RAPD-спектр линий кукурузы при использовании праймера ОРА 07

Название зоны	Номера образцов
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
ОРА 07 750	1	1	1	1	0	0	1	1	0	1
ОРА 07 500	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 07 350	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
ОРА 07 125	1	1	0	0	0	0	0	0	0	1

Таблица 6. RAPD-спектр линий кукурузы при использовании праймера ОРА 13

Название зоны	Номера образцов
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
OPF 06950	1	0	0	0	0	0	0	0	0	0
OPF 06 500	1	1	1	0	0	0	0	0	1	1
OPF 06350	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
OPF 06280	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

По локусу ОРF 06 500 ампликоны выявлены у Юбилейной-50, линий 4, 6, 28, 30. У линий 8 (9), 8 (11), 9, 14, 20 ампликоны не выявлены (Таблица 6. 1- маркер; 2-Юбилейная-50; 3-линия 4; 4-линия 6; 5-линия 8 (9 ряд); 6-линия 8 (11 ряд); 7-линия 9; 8- линия 14; 9- линия 20; 10- линия 28; 11- линия 30; 12- «-» контроль).

В ходе исследований выявлено и проанализировано 29 локусов. Размеры полученных ампликонов варьировали в пределах от ~125 до ~2500 п.н..

Для Юбилейной-50 выявлен уникальный ампликон по локусу ОРF 06 950, который в дальнейшем может служить маркером для идентификации данного сорта.

Выявлены различия между подлиниями 8 (9) и 8 (11), что говорит о гетерогенности этой линии. На основании результатов анализа считаем необходимым выделение их в самостоятельные линии.

На основании суммарной матрицы RAPD-спектров с помощью программы Treeconw определены генетические дистанции между само-опыленными линиями кукурузы селекции КБГУ и родительским сортом Юбилейная-50.

Под действием химических мутагенов и многолетнего самоопыления линии приобрели специфичные нуклеотидные последовательности, что и обуславливает выявление специфического для каждой линии RAPD-спектра ДНК фрагментов и определяет генетические дистанции на дендрограмме.

На дендрограмме видно, что после многолетней селекции более всего отличаются от исходной родительской формы линии 8 и 9. Более сходны с родительской формой линии 4, 6 и 30. Наибольшая генетическая дистанция выявлена между линиями 4 и 9.

На основе полученных данных возможно дальнейшее проведение полевых опытов по установлению обаснованности прогнозирования гетерозиса по результатам RAPD-анализа и выявленных генетических дистанций [9].

Полученные спектры RAPD-фрагментов для каждой опытной линии кукурузы позволят их в дальнейшем идентифицировать, дифференцировать и проводить сравнительный молекулярно-генетический анализ с аналоговыми линиями других источников, а также, по литературным данным, даст возможность прогнозировать гетерозис на основе генетических дистанций по результатам молекулярно-генетических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для анализа были подобраны 6 RAPD праймеров. В ходе исследований выявлено и проанали- зировано 29 локусов. Для каждого исследуемого образца получен уникальный спектр ДНК фрагментов RAPD-методом. По локусу ОРF 06 950 выявлен уникальный ампликон Юбилейной-50, который в дальнейшем может служить частью маркерной системы для идентификации данного сорта [10].

В ходе работы установлено, что после действия мутагенов и многолетней селекции более всего отличаются от исходной родительской формы линии 8 и 9. Более сходны с родительской формой линии 4, 6 и 30. Наибольшая генетическая дистанция выявлена между линиями 4 и 9.