Молекулярно-генетический анализ трансгенных клеточных линий мягкой пшеницы с использованием IRAP ПЦР

Технология генетической трансформации имеет большие перспективы в селекции растений для улучшения хозяйственно полезных признаков, в частности урожайности, повышения качества, устойчивости к патогенам и вредителям [1]. Для пшеницы перспективным методом генетической инженерии является биолистическая трансформация, поскольку ткани этой культуры имеют низкую чувствительность к агробактериальной инфекции [2]. На сегодняшний день большинство протоколов получения генетически модифицированных организмов предполагает использование культуры in vitro , в том числе этапы образования каллуса и регенерации растений. Следует учитывать, что при этом может возникать значительное число мутаций, известных под общим названием сомакло-нальной изменчивости [3]. Однако кроме мутагенного эффекта культуры тканей, процесс трансформации сопровождается дополнительным стрессом, связанным как с механическим поранением (при использовании бомбардировки микрочастицами), так и с встраиванием генетической конструкции в геном реципиента [4].

Несмотря на то, что темпы получения и выращивания генетически модифицированных культур постоянно возрастают, все еще остается вопрос насколько точно современные методы генетической инженерии могут обеспечить перенос в геном чужеродных генов и сколько непредсказуемых генетических и эпигенетических эффектов при этом может возникать [5]. Следствием переноса чужеродной ДНК может быть нарушение стабильности генома трансформированного растения, однако данной проблеме уделяется недостаточно внимания, хотя такие исследования связаны не только с фундаментальными вопросами организации и функционирования генома в целом, но также с проблемой безопасности употребления трансгенных растений.

Показано, что интеграция чужеродной ДНК в ядерный геном может вызвать как эпигенетические изменения, в частности изменения уровня метилирования ДНК, так и активацию транскрипции мобильных генетических элементов (МГЭ) [6]. Matzke и сотрудники [7] получили данные, которые убедительно свидетельствуют о том, что в присутствии трансгенов в геноме реципиента наблюдается повышение частоты генетических перестроек и активация МГЭ. Явление транспозиции представляет значительный интерес, поскольку показана его роль как в изменении экспрессии структурных генов, так и индукции хромосомных аберраций [8].

IRAP-анализ (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) - метод амплификации геномной ДНК между близко расположенными последовательностями ретротранспозонов. Одним из преимуществ этого метода является возможность одновременного анализа многих локусов в различных участках генома, что особенно важно при культивировании in vitro . Широкое присутствие в геноме растений мобильных генетических элементов и их способность к самостоятельному копированию позволяет методом IRAP-анализа идентифицировать относительно недавние изменения генома, в том числе вызванные действием стрессовых факторов. Одним из мобильных элементов, который используется для анализа генома растений является соевый ретротранспозон SIRE 1, относящийся к семейству Ty1-copia -подобных ретроэлементов. Он присутствует в геноме многих видов растений, в том числе и пшеницы, имеет длину примерно 12 т.п.н. В данной работе был использован праймер, родственный к длинным концевым повторам (LTR-последовательностям) SIRE-1. Этот участок содержит низкокопийные последовательности нуклеотидов и является одним из самых консервативных. Именно поэтому изменения в длине между последовательностями ретротранспозонов, которые можно зафиксировать, как появление/исчезновение или изменение размера IRAP-ампликона, могут служить объективным критерием изменчивости генома.

В связи с этим, целью данной работы был молекулярно-генетический анализ трансгенных клеточных линий мягкой пшеницы с использование IRAP ПЦР с праймером к LTR последовательностям ретротранспозона SIRE 1.

Каллусные культуры были получены из апекса побега 3-суточных стерильных растений пшеницы сорта Зимоярка по разработанной нами методике [9]. Исходный каллус разделяли на 2 части. Одна часть была использована для проведения генетической трансформации, другая параллельно пассировалась на питательной среде МС. Генетическую трансформацию осуществляли биолистическим методом, используя самодельную пушку типа particle inflow gun (PIG). В исследованиях была использована векторная конструкция pAHC25 [10], содержащая селективный ген фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (bar), который обеспечивает устойчивость к фосфинотрицину и репортерный ген β-глюкуронидазы (GUS). Способ получение и анализ трансгенных клеточных линий описан в работе [11].

ДНК из каллусных культур выделяли по методике Делапорта [12] с определенными модификациями, концентрацию и чистоту определяли спектрофотометрически. Для амплификации ДНК конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл: 10 мM TRIS-HCl, 50 мM KCl, 1,5 мM хлорида магния, 2 мM каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), 0,2 мкл праймера, 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы (Thermo Scientific) и 100-120 нг исследуемой ДНК. Амплификация проводилась по следующей программе: начальная денатурация при 94 °С 5 мин, 37 циклов (денатурация 94 °С - 30 с, отжиг 58 °С - 90 с, элонгация 72 °С - 2 мин) и финальная элонгация 72 °С 10 мин. Для проведения ПЦР был использован единичный праймер к LTR

M 1

ретротранспозона SIRE 1, имеющий следующую нуклеотидную последовательность: 5'-GCACTTATGCAAGTGGGATCAGC-3 [13]. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1,6% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Спектры продуктов ПЦР визуализировали под УФ лучами. Для оценки размеров ампликонов применяли маркер 100 bp DNA Ladder (Thermo Scientific). Размер продуктов ПЦР определяли с помощью пакета прикладных программ TotalLab v.2.01 (Nonlinear Dynamics) [14]. Для количественной оценки полученных результатов данные были представлены в виде бинарных матриц в которых наличие/отсутствие одинаковых по размеру ампликонов соответствовало значение 1 или 0. Проверку стабильности ПЦР реакции, осуществляли путем трехкратного повторения амплификации с одним и тем же праймером на том же растительном материале.

Известно, что в процессе совместной эволюции сформировались механизмы, защищающие геном хозяина от чужеродной транспозиции, в частности описано ее подавление на транскрипционном (сайленсинг путем метилирования ДНК) и посттранскрипционном (сайленсинг за счет РНК-интерференции) уровнях [15]. Поэтому в обычных условиях активность ретротранспозонов отсутствует или наблюдается на незначительном уровне [16]. В условиях эксперимента нам не удалось зафиксировать транспозицию у исходных и контрольных форм. В целом, у нетрансформированного первичного каллуса, а также каллуса 3-го и 6-го пассажей обнаружено 10 четких ампликонов, размером от 407 до 1360 п.н. У всех исследуемых объектов выявлен идентичный спектр продуктов ПЦР. На рис. 1 представлено по одному образцу из каждой исследуемой выборки.

• 2 3

  

  Рис. 1. Спектр продуктов амплификации ДНК контрольного нетрансформированного каллуса: М - маркер молекулярных масс (100 bp DNA Ladder), 1 – первичный каллус (0 пассаж); 2 - каллус 3 пассажа; 3 - каллус 6-го пассажа

  
  

Следующим этапом исследований было выявление полиморфизма ДНК у трансформированных форм. Для этого отбирали образцы каллусных линий LТ1-LТ7. Полученные результаты представлены на рис. 2.

М 1      2

3       4        5        6

1500 п.н. –

1000 п.н. –

500 п.н. –

Рис. 2. Спектр продуктов амплификации ДНК трансформированных каллусных линий: М - маркер молекулярных масс (100 bp DNA Ladder), 1 - клеточная линия LТ1, 2 - клеточная линия LТ2, 3 - клеточная линия LТ3, 4 -клеточная линия LТ4, 5 - клеточная линия LТ5, 6 - клеточная линия LТ6, 7 - клеточная линия LТ7. Стрелками показаны новые ампликоны

На полученных электрофореграммах продуктов ПЦР каждый ампликон соответствует анонимному локусу между двумя близко расположенными копиями SIRE-1, поскольку применен праймер, родственный к LTR-последовательности, а общая длина этого ретротраспозона составляет около 12 тыс. п.н., что делает невозможным синтез фрагментов в пределах одной копии. Таким образом, каждый но- вый выявленный ампликон фиксирует возникновение нового межретранспозонного локуса, то есть свидетельствует о событии транспозиции. Нами отмечено появление новых, относительно высокомолекулярных (длиной более 1000 п.н.) ампликонов у трех трансгенных линий - LТ2, LТ6 и LТ7 (табл.). В частности, у двух последних обнаружено по два новых фрагмента.

Таблица. Длина новых, выявленых у трансгенных линий, ампликонов

Линия	Количество новых ампликонов, шт.	Длина амликона, п.н.
LТ2	1	1567
LТ6	2	1491, 1660+*
LТ7	2	1075, 1660+*

Прим. * - При расчете длины ампликона на пакете прикладных программ TotalLab v.2.01 получено значение 1660 п.н. (линия LТ6) и 1651 п.н. (линия LТ7), однако поскольку разница между этими значениями меньше инструментальной погрешности метода (включающей разрешающую способность электрофоретического метода и погрешность вычисления), фрагменты нами условно обозначены как 1660+, что может свидетельствовать как об их идентичности, так и о несхожести по нуклеотидному составу (межретранспозонному локусу)

Появление нескольких новых ампликонов, а также то, что они были обнаружены у трех из семи исследуемых клеточных линий, может свидетельствовать об относительно высокой частоте события транспозиции в ДНК трансформированных клеточных линий. В исследуемых локусах, фланкированных LTR ретротранспозона SIRE-1, нами не выявлено точечных мутаций в сайтах связывания с праймером и/или делеций, которые могли бы приводить к исчезновению ампликона в ДНК- профилях ПЦР.

Следует отметить, что в литературе была описана транспозиционная активность ретротранспозонов Tos17 у трансгенных растений риса [4] и Tag1 у арабидопсиса [17]. Авторы также отмечают отсутствие такой активности у контрольных форм. Хотя использованный нами метод не позволяет непосредственно выявить транскрипционную и транспозиционную активность ретротранспозонов, однако он может быть быстрым и эффективным инструментом исследования изменений генома при генетической трансформации и подтверждения транспозиции МГЭ.

Таким образом, нами проведен молекулярногенетический анализ трансгенных клеточных линий мягкой пшеницы с использование IRAP ПЦР с праймером к LTR последовательности ретротранспозона SIRE 1. У трех трансформированных линий

• - LТ2, LТ6 и LТ7 обнаружено появление новых, относительно высокомолекулярных (длиной более 1000 п.н.) ампликонов, что свидетельствует о транспозиции данного мобильного генетического элемента. Поскольку эти фрагменты отсутствовали в спектрах продуктов амплификации ДНК контрольного нетрансформированного каллуса, это дает основания считать индукцию транспозиции SIRE 1 связанной с геномным стрессом, вызванным встраиванием чужеродной ДНК (векторной конструкции pAHC25) или стрессом непосредственно связанным с процессом трансформации (микропоранение, культивирование на селективных средах).

• 1.    Clive J. Global Status of Commercialized Biotech // GM Crops. 2011. ISAAA Brief. N. 43. P. 1-8.

• 2.    Rakszegi M., Tamas S., Szucs P. et al. Current status of wheat transformation // J. Plant Biotechnology. 2001. V. 3. P. 67-81.

• 3.    Gaspar T., Franck T., Bisbis B. et al. Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures // Plant Growth Regul. 2002. V. 37. P. 263-285.

• 4.    Wu R., Guo W.L., Wang X.R., et al. Unintended consequence of plant transformation: biolistic transformation caused transpositional activation of an endogenous retrotransposon Tos17 in rice ssp. japonica cv. Matsumae // Plant Cell Reports. 2009. V. 28. N 7. P. 1043-1051.

• 5.    Lu B.R., Snow A.A. Gene flow from genetically modified rice and its environmental consequences // Bio. Sci. 2005. V. 55. P. 669–678.

• 6.    Muller K., Heller H., Doerfier W . Foreign DNA integration. Genome-wide perturbations of methylation and transcription in the recipient genomes // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 14271-14278.

• 7.    Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome defense: implications for the evolu-

  tion of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 401-415.

• 8.    Kumar A., Bennetzen J.L. Plant retrotransposons // Annu. Rev. Genet. 1999. V. 33. P. 479-532.

• 9.    Бавол А.В., Дубровна О.В., Лялько І.І. Регенерація рослин із експлантів верхівки пагона проростків пшениці // Вісник Українського товариства генетиків і селекціоне-рів. 2007. Т .5. № 1-2. С. 3-10.

• 10.    Christensen A.H., Quail P.H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Res. 1996. V .5. N 3. Р. 213-218.

• 11.    Бавол А.В., Моргун Б.В. Нітовська І.О., та ін. Генетична трансформація пшениці з використанням калюсних культур, отриманих з апікальної меристеми пагона // Дося-гнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: збірник наук. праць. 2012. Т .4. С. 411-416.

• 12.    Delporte F., Mostadel O., Jacquemin J. Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001. V. 67. N 2. P. 73-80.

• 13.    Календарь Р.В., Глазко В.И. Типы молекулярногенетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 34. № 4. С. 279-296.

• 14.    Nei M., Li W.H . Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. V. 76. Р. 5269-5273.

• 15.    Casacuberta J.M., Santiago N. Plant LTR-retrotransposons and MITEs: control of transposition and impact on the evolution of plant genes and genomes // Gene. 2003. V. 311. P. 1-11.

• 16.    Vicient C.M. Transcriptional activity of transposable elements in maize // BMC Genomics. 2010. V. 11. N. 601. P. 1-10.

• 17.    Bhatt A.M., Lister C., Crawford N., Dean C. The transposition frequency of Tag1 elements is increased in transgenic Arabidopsis lines // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 427–434.

ANALYSIS OF TRANAGENIC CELL LINES OF BREAD WHEAT USING IRAP PCR