Молекулярно-генетическое исследование гемофилии А в России



В.В. Саломаткина1, О.С. Пшеничникова1, Ф.Г Перина2, В.Л. Сурин1

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОФИЛИИ А В РОССИИ

¹ ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», Москва

² ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», Екатеринбург

Введение . Гемофилия А (ГА) – распространенное Х-сцепленное генетическое заболевание (около 1 на 5000 мужчин), обусловленное отсутствием или дефектами фактора свертываемости крови FVIII, кодируемого геном F8. Генетические нарушения, приводящие к ГА, в большинстве своем уникальны за исключением двух часто повторяющихся инверсий в области интронов 22 (inv22) и 1 (inv1), обуславливающих около 50% и 5% случаев тяжелой ГА, соответственно.

Цель . Определение спектра мутаций в гене F8, характерного для больных ГА в России, и оптимизация на его основе алгоритма молекулярной диагностики этого заболевания.

Материалы и методы. Материал от больных ГА и представителей их семей был собран в рамках многолетней работы по молекулярной диагностике ГА в России. Тотальную ДНК выделяли из цельной крови и сухих пятен крови с помощью фенолхлороформного метода. При поиске мутаций в гене F8 у больных с тяжелой формой ГА сначала проверяли наличие инверсий inv22 и inv1, после чего для тех, у кого они не были выявлены, проводили секвенирование по методу Сэнгера всех экзонов и экзон-интронных сочленений гена F8. У пациентов со средней и легкой формами ГА сразу начинали поиск мутаций секвенированием. Протяженные делеции определяли по устойчивому отсутствию амплификации отдельных экзонов при успешной амплификации других.

Результаты. В исследование были включены 275 семей, затронутых ГА. Семьи были представлены пробандами (250), облигатными носительницами заболевания в случаях, когда материал от пробандов был недоступен (21), а также в четырех случаях – женщинами, больными ГА. Форма ГА была известна для 249 семей, большинство из них имело тяжелую форму ГА (N=220, 88%), в то время как больных с легкой и средней формами было значительно меньше (N=6 (3%) и N=23 (9%), соответственно). В 84 случаях (30% выборки) было известно о наличии семейной истории ГА, в остальных случаях данных о других больных ГА в составе семьи не было. Для 270 пациентов из 275 нам удалось выявить нарушения в гене F8, оставшиеся пять пациентов страдали тяжелой формой ГА, однако секвенирование всех функционально значимых участков гена F8 не выявило никаких отклонений от нормы; также у них не были обнаружены inv22 и inv1. Таким образом, согласно нашим данным, сочетание проверки на inv22 и inv1 с секвенированием по методу Сэнге- ра позволяет успешно идентифицировать генное нарушение в 98% случаев ГА. В тех случаях, когда нарушение не было выявлено, ГА может вызываться глубокими интронными мутациями, нестандартными инверсиями и дупликациями фрагментов гена. В исследованной выборке пациентов было выявлено 137 случаев inv22; для 123 из них установлена тяжёлая форма ГА, т.е. частота inv22 составила 56% от числа случаев тяжелой ГА в выборке, что соответствует литературным данным. Было выявлено 9 случаев inv1 и 3 случая inv1, сопряженной с делецией или дупликацией прилежащих регионов. Помимо частых инверсий, выявлено 96 различных генетических нарушений, 90 из них представляли собой точечные дефекты (миссенс-мутации, микроделеции, микроинсерции, indel варианты), 61 из которых не были ранее описаны в мировой литературе. Также выявлено пять больших делеций (1,8% от общей выборки или 2,3% от числа больных с тяжелой ГА) с удалением от одного до восьми экзонов; в трех случаях из пяти в формирование делеции был вовлечен интрон 6, в двух оставшихся – интрон 22. У одного из пациентов было выявлено генетическое нарушение неясной природы, включающее разрыв в экзоне 14; возможно, имела место крупная инверсия. Только 12 мутаций, помимо частых инверсий, встречались более одного раза, остальные нарушения были уникальны. У семи из восьми пациентов из Свердловской области с легкой формой ГА была выявлена замена p.His634Arg в экзоне 12, уникальная для этого региона. Также несколько раз встретились инсерции и делеции нуклеотидов в составе полиадениновых трактов в экзоне 14, найденные суммарно в 10 семьях. Из четырех женщин, имевших клинические проявления ГА, в трех случаях нам удалось выявить мутацию в сочетании с асимметричной инактивацией X-хромосомы. В одном случае были выявлены две мутации.

Выводы . Определенные нами частоты встречаемости инверсий inv22 и inv1 соответствуют описанным для других популяций. Частота мутаций, не выявляемых сочетанием поиска inv22 и inv1 и секвенированием по Сэнгеру составляет 2%. Частота больших делеций среди больных с тяжелой формой ГА также составляет около 2%. Для пациентов с легкой формой ГА, происходящих из Уральского региона, секвенирование экзона 12 представляется целесообразным первым шагом.