Молекулярное клонирование ДНК с использованием плазмид, содержащих ген устойчивости к канамицину

Клонирование генов - процесс создания копий определенного гена с использованием методов молекулярной биологии. Молекулярное клонирование - процесс извлечение последовательности ДНК или гена из одного источника и введение в вектор (плазмиду). После проведения данной процедуры полученный вектор можно использовать для создания множества копий ДНК, экспрессии белка, а также для модификации последовательности для изменения функций белка. Начало развитию методов молекулярного клонирования послужило открытие в 70-х годах XX века эндонуклеаз рестрикции и лигазы [1-4], а затем получили дальнейшее развитие с развитием методов ПЦР и сайт-направленного мутагенеза, позволяющих изменять последовательность генов ДНК.

Молекулярное клонирование ДНК с помощью классического подхода, основанного на рестрикции и лигировании, неизменно включает в себя четыре основных этапа: рестрикцию ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК c вектором, трансформацию в компетентные клетки и скрининг колоний. Тем не менее, существуют несколько альтернативных способов, которые могут быть применены в зависимости от конкретных целей. В XXI веке появилось много новых методов клонирования, таких как Gateway, сборка по Гибсону, Golden Gate, бесшовное клонирование и другие [5-10]. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, а также свою область применения. Кроме того, следует отметить, что все методы молекулярного клонирования считаются относительно сложными биотехнологическими методами, имеющими множество особенностей проведения процедуры.

Тем не менее, вне зависимости от метода молекулярного клонирование конечным продуктом является бактерия, содержащая полученную в результате проведения процедуры плазмиду. Необходимыми элементами плазмиды являются последовательность начала репликации необходимая для деления плазмиды и ген, кодирующий белок устойчивости к антибиотику, требующийся для селекции бактерий, содержащих плазмиду. Наиболее часто используемым антибиотиком для селекции является ампициллин, но также используются и другие антибиотики, такие как канами-цин [11].

Устойчивость бактерий к канамицину кодирует              аминогликозид-3'- фосфотрансфераза – фермент, катализирующий фосфорилирование аминогликозидов [12]. Аминогликозиды – соединения, образующие связь с бактериальными рибосомами, тем самым нарушая биосинтез белка и вызывая гибель бактериальной клетки. Фосфорилирование аминогликозида, такого как канамицин, приводит к нарушению его связывания с рибосомой и деактивировации антибиотика [13]. Поэтому если бактерия, такая как E. coli, получает плазмиду, содержащую ген с ами-ногликозид-3'-фосфотрансферазой, то клоны данной бактерии получают устойчивость к антибиотику канамицину.

Во многих случаях использование плазмидных векторов, содержащих ген устойчивости к канамицину, в молекулярном клонировании приводит к низкому выходу количества колоний или вообще к неудачному клонированию. Мы сообщаем о методики молекулярного клонирования ДНК в плазмиды, содержащие ген устойчивости к антибиотику канамицину, позволяющей проводить молекулярное клонирование также эффективно, как при использовании плазмиды, содержащей ген устойчивости к антибиотику ампициллину.

МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование. Плазмида    pSB-IR-CA-EM7-Koz-NeoR-T2A- mCherry, использованная в экспериментах получена лигированием двух фрагментов ДНК. В качестве исходной плазмиды была использована плазмида pSB-IR-CA-EM7-Koz-PuroR-T2A-mGFP, ранее полученная в нашей лаборатории. В первом случае модельного клонирования ПЦР-фрагмент, содержащий ген канамицина, был ампли-фицирован из плазмиды pSLIK-Neo-TGmiR-Luc (Addgene plasmid # 25745 ;

                ;

RRID:Addgene_25745) с использованием праймеров          43-NeoR-Koz-AgeI-F

(GGTTGGACCGGTGCCACCATGATTGA ACAAGATGGATTGCACG) и 32-NeoR-AspA2I-R (GCCCTCCCTAGGGAAGAACTCGTCAA GAAGGC), рестрицирован эндонуклеазами рестрикции AsiGI и AspA2I и клониро- ван в плазмиду pSB-IR-CA-EM7-Koz-PuroR-T2A-mGFP по тем же сайтам рестрикции. В втором и третьем случаях модельного клонирования ПЦР-фрагмент, содержащий ген флуоресцентного белка mCherry, был амплифицирован из плазмиды       pCDH-CMV-mCherry-T2A-Puro

(Addgene plasmid #    72264    ;

                ;

RRID:Addgene_72264) с использованием праймеров              24-eGFP-NheI-F

(GGCCCTGCTAGCGTGAGCAAGGGC) и 39-eGFP-BcuI-R

(CCCGGGACTAGTTACCCGTCGACCTT GTACAGCTCGTCC), рестрицирован эндонуклеазами рестрикции AsuNHI и AhlI и клонирован в плазмиду pSB-IR-CA-EM7-Koz-PuroR-T2A-mGFP по тем же сайтам рестрикции.

Трансформация. Пробирку с компетентными клетками размораживали во льду, 25 мкл лигазной смеси, инкубировали 30 мин при 0℃. Затем прогревали смесь на водяной бане в течение 40–50 сек при 420℃, охлаждали до 0℃, добавляли 800 мкл среды SOC (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 8,55 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 0,5 мМ MgCl2, 20 мМ глюкоза) и инкубировали от 0,5 до 5 часов при 37℃. Полный объем смеси высевали на чашку Петри с твердой средой LB (1% [w/v] бактотриптона; 0.5% [w/v] дрожжевого экстракта; 1% NaCl), содержавшей соответствующие антибиотики. Инкубировали чашку при 37℃ в течение 20 часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Возможной причиной низкой эффективности молекулярного клонирования с использованием плазмид устойчивых к антибиотику канамицину может являться то, что антибиотик канамицин блокирует синтез белка, а для устойчивости бактерий E. coli к канамицину требуется синтез в достаточном количестве белка аминогли-козид-3'-фосфотрансферазы. В этом случае для нормальной работы гена белка ами-ногликозид-3'-фосфотрансферазы необходимо чтобы белок уже присутствовал в достаточном количестве в клетке. Сразу после трансформации клетки плазмида находится в релаксированном состоянии и содержит одноцепочечные разрывы. В та- ком состоянии деление плазмиды невозможно до завершения процесса репарации, а транскрипция может быть ограничена или вообще не происходить. Поэтому для нормального функционирования белка бактериальные клетки должны иметь уже функциональную плазмиду перед нанесением на чашку Петри, содержащую кана-мицин. Исходя из этого на эффективность молекулярного клонирования с использованием плазмид, обеспечивающих устойчивость к канамицину, должно влиять время преинкубации трансформированных клеток перед посевом на чашки Петри с канамицином.

Для проверки данной гипотезы было предложено три модельных эксперимента молекулярного клонирования (рис. 1).

(3600 .. 3631) 32-NeoR-AspA2I-R

(3620) AspA2

24-eGFP-NheI-F (3674 ., 3697)

AsuNHI (3680'

Рис. 1. Генетическая карта плазмиды, используемая в клонирование: а) сборка плазмиды в первом случае; б) сборка плазмиды во втором и третьем случае. Места одноцепочечных разрывов расположены на месте сайтов рестрикции AsiGI, AspA2I, AsuNHI и AhlI.

В первом случае (разрывы перекрывают ген) в плазмиду клонируется непосредственно сам ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, первый одноцепочечный разрыв фланкирует ген после промотора, второй - после стоп-кодона гена (рис. 1, а). Во втором случае (разрывы не перекрывают ген) последовательность модельного гена, в качестве которого выступает флуоресцентный белок, клонируется в плазмиду, содержащую ген аминоглико-зид-3'-фосфотрансферазы, одноцепочечные разрывы при этом находятся за тысячу нуклеотидов после гена аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (рис. 1, б). В третьем случае (контроль с ампициллином), аналогично второму, последовательность модельного гена, в качестве которого также выступает флуоресцентный белок, клони- руется в плазмиду, содержащую ген в-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину, отличие от второго случая заключается в среде посева клеток, содержащей ампициллин вместо канамицина (рис. 1, б).

Процедура молекулярного клонирования осуществлялась стандартным описанным способом [11]. После проведения процедуры трансформация также проводилась описанным способом [14], с единственным отличием, заключающимся в варьировании времени инкубации от 30 минут для 5 часов перед посевом на чашки Петри. После посева чашки Петри инкубировались в течении 20 часов и подсчитывалось количество колоний в каждой чашке (рис. 2).

Рис. 2. Посев трансформированных клеток. Указано количество колоний на каждой чашке, относительная погрешность составляет 20%. а) первый случай, посев на канамицине;

б) второй случай, посев на канамицине; в) третий случай, посев на ампициллине.

В первом случае (разрывы перекрывают ген) колонии появляются только в случае инкубации в течении четырех часов. После пяти часов инкубации количество колоний увеличивается в десять раз, но это, по-видимому, связано с тем, что клетки начинают делится, поскольку аналогичное увеличение наблюдалось в третьем случае. Во втором случае (разрывы не перекрывают ген) колонии появляются уже сразу после 30 минут инкубации, после 4-х часов инкубации наблюдалось увеличение числа трансформатов. В третьем случае (контроль с ампициллином) количество колоний было практически неизменным в течении первых 3-х часов, но наблюдалось увеличение после 4-х - 5 часов. Поскольку присутствие ампициллина не влияет на жизнеспособность клеток, увеличение число колоний связано с делением клеток.

Данные результаты подтверждают предположение, что снижение эффективности молекулярного клонирования с использованием канамицина связано с репарацией ДНК. В первом случае одноцепочечные разрывы мешают транскрипции и аминогликозид-З'-фосфотрансфераза, нейтрализующая действие канамицина не может синтезироваться немедленно. По прошествие 4-х часов повреждения плазмиды восстанавливаются и бактерии способны к делению на среде содержащей ка-намицин. В случае, если в плазмиде последовательность самого гена не повреждена, то данный эффект менее выражен и бактерии остаются жизнеспособными сразу после трансформации. В случае использования ампициллина увеличение времени инкубации после трансформации практически не сказывается на эффективности молекулярного клонирования, но длительное время (более 4-х часов) преинкубации приводит к тому, что клетки начинают делится, что является нежелательным эффектом.

Таким образом, при молекулярном клонировании с использованием плазмид, обеспечивающих устойчивость к канами-цину, можно рекомендовать увеличение времени инкубации в среде SOC после трансформации до 4-х часов. Такое увеличение времени позволяет проводить молекулярное клонирование с использованием канамицина более успешно.