Молекулярно - генетический анализ гена CYP11B2, ассоциированного с развитием артериальной гипертензии у дзюдоистов города Перми

В ходе каждой спортивной игры у спортсмена возможна работа любой мощности, поэтому тренировка должна быть направлена на развитие у единоборцев высокого уровня аэробной и анаэробной производительности. Большие энергетические затраты, высокая частота пульса, потеря веса свидетельствуют о высоких требованиях к организму спортсмена. У них наблюдается повышенная емкость легких, брадикардия, умеренная гипертрофия сердца, увеличение содержания гемоглобина в крови [Гурович, Иванова, 1977]. Все это показывает важность изучения генетической компоненты успешности спортсменов. Для сохранения их здоровья и корректировки тренировочного процесса важно знать предрасположенность единоборца к развитию физических качеств, а также предрасположенность к развитию заболеваний, например, артериальной гипертензии.

Артериальная гипертензия – это стойкое повышение артериального давления, в случае чего систолическое больше 140 мм рт.ст. и/или диастолическое выше 90 мм рт. ст. [Баранов, 2009]. Повышенное артериальное давление чаще регистрируется у мальчиков, чем у девочек. Распространенность гипертензии у детей и подростков составляет около 17% [Образцова и др., 2005]. Распространенность артериальной гипертензии у спортсменов такая же, как в общей популяции [Смоленский, Михайлова, 2017]. К факторам риска гипертензии можно отнести особенности тренировочного процесса, высокие нагрузки, большое потребление нестероидных противовоспалительных препаратов, стероидов и стимуляторов, высокий уровень стресса, а также гипертонию в семейном анамнезе [Lehmann, Keul, 1984; Longás, Casanovas, 1996; Izzo, 2009].

Артериальная гипертензия сопровождается развитием гипертрофии, увеличением жесткости миокарда, развитием диастолической дисфункции левого желудочка [Овечкин и др., 2000; Кобалава и др., 2017]. Также наряду с артериальной гипертензией повышается активность ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Querejeta et al., 2004; Dzeshka et al., 2017]. Если эти изменения возникают на фоне генетической предрасположенности, то может возникнуть фибрилляция предсердий [Dzeshka et al., 2017].

К факторам риска развития фибрилляции предсердий у пациентов с метаболическим синдромом, наряду с артериальной гипертензией, относится высокое содержание циркулирующих в крови профибро-генных субстанций - альдостерона и трансформирующего фактора роста-6ета1 [Зеленская и др., 2016]. Ген CYP11B2 (англ. cytochrome P450, family 11, subfamily B, polypeptide 2) кодирует 11/18-β-гидроксилазу – фермент, который участвует в синтезе альдостерона в клетках клубочковой зоны коры надпочечников. Альдостерон способствует повышению содержания в организме натрия и внеклеточной жидкости. В то же время альдостерон повышает чувствительность гладких мышц сосудов к сосудосуживающим веществам. Полиморфная замена в регуляторной зоне -344C>T приводит к увеличению уровня альдостерона за счет повышения экспрессии гена [Jia et al., 2013]. По литературным данным, наличие аллеля T несет в себе риск развития артериальной гипертензии. У людей с генотипом -344TT может иметь место высокий уровень альдостерона и более высокое артериальное давление при повышенном уровне потребления поваренной соли [Andersen, 2013]. Было показано, что у носителей -344Т-аллеля чаще отмечалась большая экскреция альдостерона, а также у них определялось повышенное артериальное давление, чем С/С-гомозиготы [Brand et al., 1998; Davies et al., 1999; Yu et al., 2015]. Несмотря на множество исследований данного гена, его значение как гена-маркера артериальной гипертензии у дзюдоистов практически не изучено.

Цель работы – изучение связи полиморфизма гена CYP11B2 с развитием артериальной гипертензии у дзюдоистов школы «Витязь» г. Перми.

Материал и методы исследования

Выборка для исследований включала 147 испытуемых из спортивной школы олимпийского резерва по самбо и дзюдо «Витязь» им. И.И. Пономарева г. Перми. Возраст испытуемых варьировал от 10 до 16 лет. Среди них было 130 единоборцев мужского и 17 женского пола. Единоборства являются преимущественно мужскими видами спорта, а потому в выборках преобладают лица мужского пола [Вострикова, Боронникова, Закиров, 2020].

Забор биологического материала (буккального эпителия) для генетического анализа проводили с помощью соскоба эпителиальных клеток ротовой полости. От каждого испытуемого было получено добровольное согласие на забор биологического материала. Измерение артериального давления проводили по методу Н. С. Короткова [Иванов, Лившиц, 2005] с использованием стандартных возрастных манжет при каждом визите пациента. Артериальное давление измеряли трехкратно с интервалом 5 мин. на обеих верхних конечностях с подсчетом среднего показателя. Нормальным систолическим и диастолическим артериальным давлением считается значение <90-го процентиля кривой распределения АД, высокое нормальное АД ≥90 и <95-го процентиля, АД в гипертензивном состоянии ≥95-го процентиля кривой распределения АД в популяции для соответствующего возраста, пола и роста. У подростков 16 лет используются единые критерии диагностики нормального (<130/85 мм рт. ст.), высокого нормального АД (≥130/85 мм рт. ст.) и ≥140/90 мм рт. ст. для артериальной гипертензии [Александров и др., 2009].

ДНК выделяли методом тотального осаждения и лизиса SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, додецил сульфат натрия) с помощью коммерческого набора реагентов «EX-511 ДНК-Экстран-2» (Синтол, Россия) в соответствии с инструкцией. Концентрацию проб ДНК определяли с помощью спектрофотометра SpectrofotometrTM NanoDrop 2000 «Thermo scientific» (USA). В ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) при использовании подхода распознавания аллелей (Allelic Discrimination) выявлялись аллели гена CYP11B2 , а также аллельные варианты гена или генотипы, ассоциированные с артериальной гипертензией. Реактивы для выявления полиморфных локусов T344C гена CYP11B2 (rs1799998) синтезированы в ООО «Син-тол» (г. Москва, Россия). Реактивы для амплификации ДНК смешивали в нужном объеме непосредственно перед проведением исследований. К реакционной смеси добавляли 5 мкл пробы ДНК индивидуально каждого единоборца. В качестве контроля использовали: а) отрицательный контроль (ОКО); б) положительный контрольный образец (ПКО) для гена CYP11B2 – ПКО 1 T/T, ПКО 2 T/C, ПКО 3 C/C. Определение аллелей и генотипов проводилось при помощи программы Bio-Rad (USA) на амплификато-ре CFX96 (CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System, USA). ПЦР-РВ для амплификации полиморфных локусов проводили по программе, описанной в инструкции к наборам реактивов. По каналу флуоресценции ROX (оранжевый, длина волны возбуждения/детекции 580/602 нм) качественно определялось наличие в пробе аллеля T гена CYP11B2 . По каналу флуоресценции HEX (зеленый, длина волны возбуж-дения/детекции 530/560 нм) можно обнаружить аллель C гена CYP11B2 . Каждая проба была проанализирована индивидуально. Эксперимент повторялся дважды. ПЦР-РВ проведена при условиях, предусмотренных в инструкции производителя набора реактивов ООО «Синтол». Интерпретация результатов ПЦР-РВ была проведена в программе Bio-Rad CFX Manager по инструкции компании ООО «Синтол».

Анализ полученных данных проводился с использованием программы STATISTICA 6.0 с определением нормальности распределения. Для хранения и обработки результатов исследований была создана матрица данных в виде электронных таблиц MS Excel 2010. Оценка взаимосвязи между двумя переменными (генотип и артериальное давление) осуществлялась с помощью корреляционного анализа Спирмена (r s ). Сравнение частот генотипов между разными группами испытуемых (с нормальным давлением и с артериальной гипертензией) выполняли с помощью критерия χ² – хи-квадрат.

Результаты и обсуждение

В ПЦР в реальном времени при использовании подхода распознавания аллелей (Allelic Discrimination) рост по каналу ROX указывает на присутствие аллеля T гена CYP11B2 (рис. 1). Рост по каналу HEX обозначает наличие аллеля С гена CYP11B2 в пробе ДНК. Соответственно, присутствие обоих аллелей в пробе свидетельствует о наличии генотипа T/С гена CYP11B2. Результаты подлежат учету только в случае, когда положительный контрольный образец имеет положительные результаты по каналам ROX и HEX, а отрицательный контрольный образец имеет отрицательные результаты по каналам ROX и HEX. Положительный контрольный образец необходим для определения специфичности набора реагентов к аллелям T и C гена CYP11B2. Отрицательный контрольный образец необходим для подтверждения отсутствия в реакционной смеси контаминации и ингибирования

По результатам ПЦР в реальном времени было выявлено, что генотип Т/Т гена CYP11B2 , ассоциированный с артериальной гипертензией, встречается у 38 человек (частота 0.26). Самый благоприятный генотип С/С, не ассоциированный с артериальной гипертензией, обнаружен у 41 человека (частота 0.28). Чаще всего в общей выборке дзюдоистов встречался генотип С/Т – у 68 человек (частота 0.46). Таким образом, можно сделать вывод, что в выборке преобладает генотип со средней предрасположенностью к развитию артериальной гипертензии, что соответствует нормальному распределению и выявленному процентному соотношению распространения гипертензии среди детей [Образцова и др., 2005].

Анализ результатов измерения артериального давления показал, что в группе дзюдоистов у 121 человека нормальное давление, а у 26 человек зарегистрирована артериальная гипертензия. Нами были выделены две группы для сравнения между собой, чтобы определить связь между генотипами исследуемых генов и артериальным давлением. Группа I включала испытуемых с нормальным давлением (121 чело- век), Группа II состояла из 26 человек с артериальной гипертензией. Сравнение частот генотипов между Группой I испытуемых с нормальным давлением и Группой II с артериальной гипертензией выполняли с помощью критерия χ2 – хи-квадрат (таблица).

Рис. 1. Кинетические кривые флуоресценции, полученные для проб ДНК из буккального эпителия единоборцев при анализе гена CYP11B2.

Цвета, соответствующие каналам детекции флуоресценции: ROX (аллель T гена CYP11B2 ) – оранжевый, HEX (аллель C гена CYP11B2 ) – зеленый; ОЕФ – относительные единицы флуоресценции, циклы – циклы амплификации

[Fluorescence kinetic curves obtained for DNA samples from the buccal epithelium of martial artists when analyzing the CYP11B2 gene.

Colors corresponding to fluorescence detection channels: ROX (T allele of the CYP11B2 gene) – orange, HEX (C allele of the CYP11B2 gene) – green; RFU – relative fluorescence units, cycles – amplification cycles]

Полиморфизм гена CYP11B2 у дзюдоистов с разным артериальным давлением (n=147) [Polymorphism of the CYP11B2 gene in judokas with different blood pressure (n=147)]

Генотипы	Группы с разным артериальным давлением (147 человек)		Частоты генотипа на общую выборку (147 человек)	χ2	r s
	Группа I – нормальное давление (121 человек)	Группа II – артериальная гипертензия (26 человек)
C/C	0.34 (41)	0 (0)	0.28 (41)	0.589	0.597
C/T	0.48 (58)	0.38 (10)	0.46 (68)
T/T	0.18 (22)	0.62 (16)	0.26 (38)

Примечание. Сравнение частот генотипов между двумя группами выполняли с помощью критерия хи-квадрат (χ²); оценка взаимосвязи между двумя переменными (генотип и наличие артериальной гипертензии) осуществлялась с помощью корреляционного анализа Спирмена (r s ); жирным шрифтом выделены значимые отличия.

С помощью критерия хи-квадрат была определена статистическая значимость между двумя выборками (Группой I с нормальным давлением и Группой II с артериальной гипертензией) и генотипами гена CYP11B2 . Значение критерия χ² эмп составляет 0.589, критическое значение χ² кр при уровне значимости p<0.05 составляет 5.991. Таким образом, связь между двумя выборками и генотипами гена CYP11B2 статистически не значима при уровне значимости р > 0.05.

С помощью корреляционного анализа Спирмена осуществлялось сравнение между двумя переменными – генотипами и наличием артериальной гипертензии. Анализ полиморфизма T344C гена CYP11B2 в двух группах у испытуемых с разным давлением выявил, что характеристики экспериментальных групп значимо отличаются друг от друга (p=0.001), т.к. уровень значимости ниже 0.05. Корреляционный анализ (по критерию Спирмена) зависимости исследуемых показателей генотипа испытуемых и наличия артериальной гипертензии выявил наличие положительной связи (r s =0.597) между этими двумя переменными. Генотип Т/Т, ассоциированный с артериальной гипертензией, встречается у 22 человек (частота 0.18) в группе с нормальным давлением (Группа I), при этом генотип С/С, не ассоциированный с гипертензией, встречается в этой же группе чаще – у 41 человека (частота 0.34). В группе испытуемых с артериальной гипертензией генотип С/С не встречается, при этом генотип Т/Т и С/Т обнаружен у 16 и 10 человек соответственно (частота 0.62 и 0.38). Таким образом, можно подтвердить ассоциацию Т аллели с артериальной гипертензией и заключить, что генотип Т/Т гена CYP11B2 имеет связь с артериальной гипертензией и в выборке испытуемых.

Распределение частот генотипов гена CYP11B2, ассоциированного с артериальной гипертензией, представлено на рис. 2.

Рис. 2. Распределение частот генотипов гена CYP11B2 , ассоциированного с артериальной гипертензией, у дзюдоистов (n=147).

Группа I с нормальным давлением, Группа II с артериальной гипертензией [Distribution of genotype frequencies of the CYP11B2 gene associated with arterial hypertension in judokas, n=147]

В данной выборке артериальная гипертензия обнаружена у 26 человек из 147 (17% от общей выборки). Не обнаружены достоверно значимые различия при анализе полиморфизма T344C гена CYP11B2 в двух группах по критерию хи-квадрат (χ² эмп = 0.589 при р > 0.05), однако при оценке взаимосвязи между генотипом и наличием артериальной гипертензии при помощи корреляционного анализа Спирмена обнаружены достоверно значимые различия (r s = 0.597). Прослеживается связь генотипа T/T гена CYP11B2 и артериальной гипертензии, таким образом, данный генотип может быть использован в качестве маркерного.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что в процессе отбора отсеиваются спортсмены с неблагоприятными генотипами. Это происходит по многим причинам, одной из которых является их низкая работоспособность, обусловленная генетически, и долгое время восстановления после тренировки. Артериальная гипертензия является мультифакторным заболеванием, в связи с чем она может проявиться в более позднем возрасте. Одним из факторов развития гипертензии является стресс, который сопровождает спортсменов и на тренировках, и на состязаниях.

В данном исследовании установлено, что генотип T/T гена CYP11B2 может быть использован в качестве маркерного для определения развития артериальной гипертензии у дзюдоистов. Данные генетического анализа будут полезны в процессе подготовки единоборцев в спортивных школах, т.к. на их основе можно составлять индивидуальные программы подготовки с учетом генотипа и особенностей физической подготовки конкретного спортсмена. Это должно привести к росту спортивных достижений, сохранению здоровья и увеличению спортивного долголетия [Kambouris et al., 2012].

На основании всех полученных данных можно сделать вывод, что для спортсменов-единоборцев немаловажное значение имеет выявление генетической предрасположенности к развитию артериальной гипертензии, т.к. ее наличие может привести к развитию более серьезных заболеваний. Также состояние здоровья спортсмена напрямую влияет на его спортивные достижения. Изучение генетической предрасположенности спортсменов позволит в дальнейшем повысить надежность и эффективность системы индивидуального отбора и подготовки высококвалифицированных спортсменов. Полученные данные еще раз доказывают, что важно уделять особое внимание состоянию здоровья и интенсивности тренировок у единоборцев.