Молекулярные биомаркеры глаукомы (обзор)

Corresponding author — Tatiana G. Kamenskikh

Тел.: +7 (927) 1368905

в жидкостях и тканях организма, включая слезную жидкость, ВВ, стекловидное тело и кровь [1, 3].

Цель — проанализировать имеющиеся в литературе данные о возможностях использования молекулярных биомаркеров глаукомы для раннего выявления механизмов, участвующих в нейрональном повреждении ганглиозных клеток сетчатки.

Материалом обзора послужили 30 зарубежных и 10 отечественных источников из медицинских международных баз данных PubMed, Cochrane и электронной библиотеки e-Library, период электронного поиска — 2018–2022 гг.

Проведены исследования по протеомике и метаболомике для выявления биомаркеров у пациентов с глаукомой различных стадий по сравнению со здоровыми людьми и пациентами с возрастной катарактой с определением большого количества факторов в различных биологических тканях и жидкостях, включая слезную пленку, ВВ и кровь (сыворотка) [4, 5]. Результатом было получение большого количества белков и метаболитов (> 450), предполагающих связь с заболеванием первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ), но вопрос о том, является ли какой-либо из предполагаемых биомаркеров причиной или следствием глаукомы, остается предметом дискуссий. Известно, что повышенное внутриглазное давление является основным фактором риска развития ПОУГ. Это происходит из-за повышенного сопротивления оттоку ВВ через трабекулярную сеть. Патогенные механизмы, ведущие к увеличению сопротивления оттоку ВВ, недостаточно изучены, однако известно, что они связаны с нарушением состава внеклеточного матрикса трабекулы. На состояние внеклеточного матрикса влияет взаимодействие факторов роста, таких как семейство трансформирующих факторов роста (TGFβ) и матриксных металлопротеиназ (MMP). Повышенные уровни TGFβ-2 приводят к увеличению отложения внеклеточного матрикса (фибронектин), что приводит к нарушению оттока ВВ. Тромбоспондины (TSP-1 и -2) являются важными регуляторами состояния трабекул. TSP-1 участвует в патогенезе ПОУГ посредством активации TGFβ-2 в трабекулярной сети. TSP-2 способен опосредовать активность MMP 2 и 9. Экспрессию TSP-1 и -2 изучали в трабекуле глаза человека с помощью иммуноцитохимии, иммуноблоттинга после обработки TGFβ-2 и дексаметазоном. Уровень белка фибронектина определяли в клетках трабекул с помощью иммуноблоттинга после обработки TSP-1 или -2. Обработка TSP-2 повышала экспрессию белка фибронектина, TSP-1 не влиял на уровни белка фибронектина в трабекуле. Таким образом, TSP-2 может быть вовлечен в патогенез ПОУГ и способствовать повышению уровня внутриглазного давления за счет увеличения отложения фибронектина в трабекуле в ответ на TGFβ-2 [6].

Проведено молекулярно-генетическое исследование восьми полиморфных локусов генов MMP. Исследование показало то, что межгенные взаимодействия полиморфных локусов ММР ассоциированы с формированием ПОУГ у мужчин [7]. Проводилась оценка уровней оксида азота, эндотелина-1, TGFβ-1 в сыворотке крови пациентов с псевдоэксфолиатив-ной глаукомой (ПЭГ) для определения их роли в развитии и прогрессировании данного вида патологии. Концентрации TGFβ-1 и эндотелина-1 в сыворотке крови были повышены, а содержание оксида азота снижено у пациентов с ПЭГ в сравнении с группой контроля. Определена линейная зависимость между концентрацией эндотелина-1, оксида азота, TGFβ-1 в сыворотке крови и стадией псевдоэксфолиативной глаукомы [8]. Изучено содержание TGFβ-2 в ВВ, полученной при исследовании (ELISA) 126 глаз больных глаукомой. Концентрация TGFβ-2 у пациентов с ПОУГ достоверно выше, чем в контрольной группе. TGFβ-2 у пациентов с высоким внутриглазным давлением (> 21 мм рт. ст.) достоверно выше, чем у пациентов с нормальным внутриглазным давлением [9, 10].

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) открыт в 1989 г. Это основной ангиогенный фактор, принимающий участие в новообразовании сосудов. Нормальное развитие сосудов и нервной ткани глаза возможно только при присутствии различных концентраций разных изоформ VEGF. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что ишемия и аксонотомия активизируют выработку VEGF ганглиозными клетками сетчатки. Выявлено повышение уровня VEGF в субретинальной жидкости, мембранах и стекловидном теле у больных глаукомой [11].

Проанализирована панель цитокинов, включая интерлейкины: IL-1β, -2, -6, -7, -8, -10, -17A, -23, моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), фактор некроза опухоли (TNF-α), плацентарный фактор роста (PlGF) и VEGF у пациентов с глаукомой, возрастной макулярной дегенерацией (ВМД), тапето-ре-тинальной абиотрофией (ТРА), и катарактой. Оказалось, что только концентрация IL-8 были выше в ВВ пациентов с глаукомой по сравнению с контрольной группой [12, 13]. По данным литературы, использование алгоритмов машинного обучения в анализе данных 28 уровней иммунных медиаторов, полученных из ВВ пациентов с различными глазными заболеваниями, включая ПОУГ, обеспечило прогноз ПОУГ при использовании маркеров MCP-1 и IL-6 [14]. Содержание интерлейкинов в слезной жидкости изучено у 80 больных глаукомой II стадии и 45 практически здоровых лиц методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с расчетом информативности показателей иммунитета. Установлена высокая диагностическая значимость для верификации глаукомы IL-2, -17, -8, которые предлагается использовать при лабораторной диагностике и прогнозировании заболевания. Созданная регрессионная модель обеспечивает с высокой точностью прогнозирование развития глаукомы при повышении уровня IL-2, -17, -8 [15]. Изучение содержания интерлейкинов в слезной жидкости также проводилось на иммуноферментном анализаторе Multiscan (Финляндия) посредством метода сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа. Наибольшее повышение содержания локальных интерлейкинов у больных глаукомой выявлено для IL-2 и -17 в 8,4 и 8,3 раза соответственно. В слезной жидкости больных ПОУГ существенно возросло также содержание IL-8. Оценка диагностической значимости по величине информативности локальных интерлейкинов свидетельствует о максимальной информативности IL-2 (J=637,4) и IL-17 (J=612,8), что указывает на ведущее их значение в диагностике ПОУГ. Высокий уровень информативности характерен для IL-8 (J=572,5). По наиболее информативным интерлейкинам в слезной жидкости с помощью регрессионного анализа разработана математическая модель, обеспечивающая с высокой вероятностью (р<0,001) прогнозирование ПОУГ [16]. Однако некоторые авторы считают, что определение уровня цитокинов в сыворотке крови, слезной жидкости не может точно и полностью отражать внутриглазной статус, поскольку биологически активные молекулы могут секретироваться клетками различных тканей. До настоящего времени, несмотря на достаточно большое количество исследований, нет четкого представления о характере, механизмах межклеточных взаимодействий и их роли в происходящих структурных, биохимических и функциональных изменениях в трабекулярном аппарате, зрительном нерве и сетчатке при глаукоме [17]. Местное лечение антиглаукомны-ми препаратами может способствовать локальному воспалению. Оценивали концентрации провоспали-тельных цитокинов в слезе и ВВ пациентов с ПОУГ, получавших местное лечение с помощью мультиплексного иммуноанализа. Уровни IL-5, -12, -15, интерферона-γ (IFNγ) значительно выше в ВВ глаз с глаукомой. Увеличение IL-4, -12, -15, основного фактора роста фибробластов (FGF—в) и VEGF наблюдали в образцах слезы больных ПОУГ [18]. Обнаружено, что содержание фактора дифференцировки роста 15 (GDF15) повышено в ВВ пациентов с ПОУГ, его присутствие связано с худшим прогнозом состояния зрительных функций у лиц с ПОУГ и ПЭГ, поэтому он был предложен в качестве маркера степени тяжести глаукомы [19].

Матрицеллюлярные белки (группа внеклеточных белков) широко экспрессируются в глазах с глаукомой. Это позволяет предположить, что они могут играть важную роль в патогенезе заболевания. Уровни CTGF — матрицеллюлярного белка, который может играть роль в отложении эластического микрофибриллярного эксфолиативного материала и взаимодействует с цитокином TGF-в, определяемые с помощью иммуноферментного анализа, значительно выше в ВВ пациентов с ПЭГ, чем ПОУГ, так и у контрольных субъектов, тем не менее повышение концентрации CTGF не было хорошим предиктором ПЭГ или псевдоэксфолиативного синдрома (ПЭС) в слезе или ВВ, что демонстрирует высокую вариабельность и отсутствие надежности данного биомаркера [20, 21]. Матрицеллюлярные белки периостин (PN) и тенасцин-С (TNC) изучены в целевом анализе в ВВ пациентов с неоваскулярной глаукомой, выявлены значительно их более высокие уровни при сравнении пациентов с неоваскулярной глаукомой и с пролиферативной диабетической ретинопатией. Интересно, что у пациентов с неоваскулярной глаукомой наблюдалась значительная экспрессия PN в трабекулярной сети и шлеммовом канале [22]. Обнаружено, что уровни фибулина (FBLN-7) — молекулы адгезии, взаимодействующей с молекулами внеклеточного матрикса, участвующими в поддержании функциональности трабекулярной сети, — снижаются в ВВ пациентов с первичой закрытоугольной глаукомой по сравнению с ПОУГ и пациентами контрольной группы [23]. Определено содержание кла-стерина (CLU) в ВВ и слезе пациентов с ПОУГ, ПЭГ и здоровых пациентов с помощью ELISA, причем более высокие уровни CLU были в ВВ у пациентов с ПЭГ [24].

Недавние исследования способствовали улучшению понимания метаболического профиля ВВ у пациентов с глаукомой. Ряд исследователей [25] провели протеомную характеристику ВВ пациентов с ПОУГ, наблюдали значительные изменения 150 протеинов крови по сравнению с контрольной группой (больные с катарактой), большинство из которых связаны с каскадом комплемента. Количественный подход показал снижение концентрации таурина и повышение концентрации креатинина, карнитина в группе больных с глаукомой по сравнению с контрольной группой [26]. В ходе другого исследования в группе больных глаукомой выявлено более высокое содержание бетаина, таурина и глутамата, что может указывать на выраженный окислительный стресс, эксайтоток-сичность и активацию нейропротекторных механизмов [27]. У пациентов с ПОУГ выявлено, что глицин является потенциальным биомаркером для более ранней диагностики [28]. Для пациентов с ПОУГ предложено 14 метаболических биомаркеров-кандидатов, в том числе повышенная концентрация пеларгоновой кислоты и галактозы 1 и пониженное содержание глюкозо-1 фосфата, сорбита и спермидина [29].

В последнее время исследуют маркеры, связанные с аутоиммунитетом. Проведено исследование изменений в профиле аутоантител путем нацеливания на антигены в трабекулярной сети в качестве биомаркеров для раннего выявления ПОУГ [30]. Авторы предложили комплексный подход, основанный на серологическом анализе протеома для обнаружения аутоантител. Уровень кальдесмона (CALD1), фосфоглицератмутазы 1 (PGAM1) и потенциалзависимого белка анионселективного канала 2 (VDAC2) значительно выше у пациентов с ПОУГ по сравнению с контрольными субъектами.

Установлено, что уровни нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и нейронспецифи-ческой энолазы (NSE) в слезной жидкости пациентов с ПОУГ значимо превышали аналогичные показатели в группе контроля. Анализ содержаний BDNF и NSE в слезной жидкости показал, что имеются некоторые отличия у пациентов ПОУГ с разными стадиями процесса. Достоверное повышение концентрации BDNF в слезной жидкости у пациентов с ПОУГ II (1,37±0,41 нг/мл) и ПОУГ III (1,52±1,39 нг/мл) стадий по сравнению с нормой, вероятно, свидетельствует о потребности нейрональной сетчатки в повышении ее устойчивости к повреждающим факторам. При ПОУГ I стадии содержание NSE (0,79±0,27 нг/мл) в слезной жидкости увеличивается в 1,5 раза, при II стадии в 8,2 раза, при III стадии в 11,3 раза и при IV стадии заболевания в 1,7 раза относительно нормы, что является показателем дегенерации ганглиозных клеток сетчатки [31]. Также BDNF был определен с помощью ELISA в сыворотке больных ПОУГ и нормотензивной глаукомой (НТГ) и пациентов контрольной группы. Наблюдали значительно более низкие уровни в обеих группах глаукомы, чем в контроле [32], что заслуживает дальнейшего изучения этого фактора как потенциального биомаркера для раннего выявления глаукомы. Исследована слезная жидкость у 23 пациентов с ПОУГ II и III стадий. В слезной жидкости определяли концентрацию BDNF и NSE методом иммуноферментного анализа с последующим расчетом их соотношения BDNF/NSE. При ПОУГ определяется изменение уровней BDNF и NSE в слезной жидкости относительно контроля в сторону превалирования маркеров нейродегенерации у 38% больных со II стадией и у 45% при III стадии заболевания. Соотношение нейрональных маркеров нейротрофики и нейродегенерации отражают возможности компенсаторно-приспособительной и патологической реакции глаза в условиях глаукоматозного процесса [33]. Концентрации антител к общему белку миелина (АТ к ОБМ) у больных ПОУГ в сыворотке крови определяли методом им-муноферментного анализа. Концентрация АТ к ОБМ достоверно выше у пациентов с I и III стадиями ПОУГ (177,5 ±63,93 и 262,63±34,78 мкг/мл соответственно), чем в группе контроля (38,69±11,77 мкн/мл, p < 0,05). Для диагностики ПОУГ у пациентов группы риска целесообразно использовать значение IgG к ОБМ>60 мкг/мл, чувствительность метода составляет 78%, специфичность 87% [34]. Галектин-3 (Gal-3) и аполипопротеин Е (АРОЕ) являются маркерами активированной микроглии при нейродегенератив-ных заболеваниях центральной нервной системы. Изучены уровни Gal-3 и АРОЕ в ВВ человека. Многофакторное линейное регрессионное моделирование выявило значимые связи между Gal-3 и максимальным зарегистрированным внутриглазным давлением (p=0,009), а также между APOE и количеством прошлых офтальмологических операций (p=0,031) [35].

У пациентов с ПЭГ обнаружена более низкая концентрация 25-гидроксивитамина D 25(OH)D в сыворотке крови по сравнению с группой контроля. Количество больных с дефицитом витамина D в группе ПЭГ значительно выше, чем в контрольной группе (86,4 и 59,5% соответственно, p <0,01) [36]. У больных НТГ образцы периферической венозной крови брали во время гипоксии и в фазе восстановления. Уровни глюкозы и лактата в сыворотке измеряли с помощью анализатора газов крови. Исходные уровни лактата и общего количества аминокислот значительно ниже у пациентов с НТГ по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы. Различий в уровне глюкозы в крови между двумя группами не обнаружено. Уровень лактата не изменился при гипоксии в контрольной группе, но увеличился у больных НТГ [37]. Уровни белка Klotho в сыворотке и ВВ ниже в группах псевдоэксфолиативного синдрома, ПЭГ и ПОУГ по сравнению с контрольной группой, но снижение было наиболее значительным в группе ПЭГ [38]. У больных НТГ снижение снабжения кислородом вызывало повышение уровня адреналина в периферической крови и его снижение в период выздоровления ( p <0,01). Показана разница температуры дистального отдела пальца у пациентов с НТГ в условиях гипоксии по сравнению с нормоксией. Гипоксия вызывала повышение уровня эндотелина-1 в периферической крови [39].

Анализ аминокислот и лактата определил системные изменения у пациентов с НТГ по сравнению с контрольной группой того же возраста, со сниженным содержанием лактата и общего количества аминокислот и повышенным содержанием валина и орнитина в когорте пациентов с глаукомой [37]. В недавнем нецелевом метаболомном исследовании плазмы пациентов с ПОУГ ( n =34) и контрольной группы ( n =30) сообщалось о нарушении содержания девяти метаболитов у пациентов с ПОУГ, включая снижение концентрации никотинамида, гипоксантина, ксантина и 1-метил-6,7-дигидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина, а также повышение уровня N-ацетил-L-лейцина, аргинина, r-глицерина, 1-миристата, 1-олеоил-РАЦ-глицерина и цистатионина, показывая нарушение митохондрий, нуклеотидов и аминокислот как факторов, способствующих патогенезу глаукомы [40].

Заключение. Идентификация молекулярных биомаркеров глаукомы может способствовать ее ранней диагностике и определению прогноза этого тяжелого заболевания, а также может помочь оценить терапевтическую эффективность лекарств, разработать новые подходы к мониторингу и медикаментозной терапии. Существует потребность в биомаркере, который может свидетельствовать о начале процесса нейродегенерации в более ранние сроки, так как сохранение зрения больных глаукомой зависит от того, насколько рано начата терапия. Однако сегодня предложены сотни биомаркеров-кандидатов (>450), но ни один из них пока не исследован в больших когортах из популяций различного происхождения, поэтому они еще не поступили в клинику. В целом несмотря на то, что к настоящему моменту достигнут значительный прогресс, все еще необходимы годы исследований, чтобы по-настоящему внедрить молекулярные биомаркеры глаукомы в клиническую практику.