Молекулярные формы малатдегидрогеназы лекарственных растений семейства сложноцветные

молекулярных форм (МФ) малатдегидрогеназы (L-малат: NAD-оксидоредуктаза, 1.1.1.37, МДГ) [1]. В современной литературе данные о МФ МДГ лекарственных растений немногочисленны. В связи с этим настоящее исследование приобретает важное теоретическое и практическое значение.

Методика исследования. Объектом исследования на молекулярном уровне явилась МДГ лекарственных растений семейства Сложноцветные ( Asteraceae ) – одуванчика лекарственного ( Taráxacum officinále L.) , ромашки аптечной (Matricária chamomílla L.) , тысячелистника обыкновенного (Achilléa millefólium L.) , календулы лекарственной ( Caléndula officinális L.) , бессмертника песчаного (Helichrýsum arenárium L.) . Определение проводилось в свежем ЛРС, а также в высушенном ЛРС после экспозиции во влажных условиях в течение 12, 24, 72 и 120 часов при Т=20⁰С. Молекулярные формы МДГ разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле и выявляли феназинметасульфат-тетразолиевой реакцией: гелевые пластины инкубировали 12 часов при 37°С в чашках Петри в оптимизированной инкубационной среде, содержащей водные растворы NAD (1 мг/мл) – 40 мл, нитросинего тетразолиевого (1 мг/мл) – 30 мл, 1 М раствора малата натрия (рН=7,0) – 10 мл, феназинметасульфата (1 мг/мл) – 4 мл, 0,2 М трис-HCl буферного раствора (рН=7,1) – до 100 мл. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих полос. Количественный анализ электрофореграмм проводили на денситометре АФ-1 («Львовприбор») в проходящем луче с фильтром 560 нм [2].

Результаты исследования и их обсуждение. Проведенный анализ свежего ЛРС позволил обнаружить две изоформы МГД – МДГ-1 и МДГ-3 в траве одуванчика лекарственного, ромашки аптечной, тысячелистника обыкновенного, календулы лекарственной, бессмертника песчаного (табл. 1). Относительная электрофоретическая подвижность МФ МДГ соответствует справочным литературным данным и является критерием для их идентификации.

Таблица 1. Относительная электрофоретическая подвижность (ОЭП) МФ МДГ лекарственных растений семейства Сложноцветные

Наибольшая активность изоформы МДГ-1 характерна для свежей травы одуванчика, календулы и бессмертника, наименьшая – для ромашки аптечной. Об этом свидетельствует интенсивность окраски и ширина зоны МДГ-1 на форе-граммах. В то же время в наибольшей степени деятельность изоформ МДГ-3 проявляется в траве тысячелистника, одуванчика и бессмертника, а в траве календулы – в наименьшей. В целом, в траве ромашки работоспособность обеих форм МДГ минимальная, а в траве одуванчика, тысячелистника и бессмертника – максимальная.

При экспозиции высушенной травы одуванчика лекарственного в условиях повышенной влажности при Т=200С в течение 12 часов происходит восстановление функций изофермента МДГ-1, сохраняющихся и через 5 суток. Спустя 72 часа после начала увлажнения начинает функционировать МДГ-3. Интенсивность окраски в зоне МДГ-3 через 5 суток выше, чем через 3 суток. Следовательно, на ренатурацию МДГ-3 требуется большее время, чем для МДГ-1.

Анализ полученных данных показал, что при хранении ЛРС травы ромашки аптечной при температуре 20оС и повышенной влажности происходит изменение деятельности изоферментов МДГ-1 и МДГ-3, аналогичное установленному в траве одуванчика лекарственного: оба фермента действуют уже через сутки после начала увлажнения. Однако если в траве одуванчика одновременно увеличивается каталитическая способность МДГ-1 и МДГ-3, то в траве ромашки рост активности МДГ-3 сопровождается снижением работоспособности МДГ-1. В свежем ЛРС ромашки и в траве после экспозиции в течение 5 суток отмечено аналогичное соотношение. Но через 5 суток после начала увлажнения активность МДГ-3 еще не достигает показателя для МДГ-3 в свежей траве.

В высушенной траве тысячелистника обыкновенного уже через 12 часов после начала увлажнения синхронно начинают функционировать оба изофермента и максимальных показателей через 5 суток. Аналогичные изменения наблюдаются на фореграммах травы одуванчика.

В высушенной траве календулы лекарственной резкая активация изофермента МДГ-1 происходит через 12 часов после начала увлажнения, о чем свидетельствует интенсивная окраска зоны изофермента. Спустя 5 суток выявленная особенность МДГ-1 сохраняется. К этому моменту восстанавливает свою структуру и функции изоформа МДГ-3. Аналогичная динамика характерна для травы одуванчика.

В ходе эксперимента обнаружено, что МДГ-1 в траве бессмертника песчаного возобновляет деятельность через 12 часов после начала экспозиции, достигая наибольших значений через 120 часов. Аналогичные закономерности обнаружены в траве календулы. Но на фореграмме МДГ инкубированной травы бессмертника видно, что зона МДГ-1 через 5 суток значительно уже, чем на фореграмме его свежей травы и на фореграмме МДГ травы календулы. Через 5 суток после начала экспозиции полностью восстанавливает свою структуру и активность изоформа МДГ-3 (начало этого процесса было отмечено на фореграмме спустя 72 часа после начала инкубации во влажной среде).

Анализ проведенных экспериментов (табл.

• 1)    выявляет следующие закономерности. Как видно из таблицы, через 12 час после увлажнения при комнатной температуре происходит восстановление структуры и деятельности изофермента МДГ-1 во всех образцах лекарственного растительного сырья, а в траве тысячелистника обыкновенного начинает работать и изоформа МДГ-3. Через 24 часа после хранения влажного сырья при комнатной температуре восстанавливает свою работу МДГ-3 в траве одуванчика лекарственного и ромашки аптечной. Спустя 3 суток изофермент МДГ-3 травы бессмертника песчаного показывает свою активность. В траве одуванчика лекарственного, ромашки аптечной и тысячелистника обыкновенного оба изофермента продолжают работать.

Обращает внимание функциональная особенность изофермента МДГ-3 травы календулы лекарственной. На его восстановление структуры и активности потребовался самый большой период времени – 5 суток. Полученные данные свидетельствуют о практически полном восстановлении конформации молекул и максимальной активности изоферментов МДГ-1 и МДГ-3 исследуемого растительного сырья спустя 5 суток после начала экспозиции его в условиях повышенной влажности. Активизация МДГ-1 указывает на усиление анаэробных процессов обмена по сравнению с аэробными процессами. О стабилизации процессов обмена и выравнивании скорости реакции окисления-восстанов-ления малата свидетельствует одинаковая активность всех МФ МДГ. Наличие только изофермента МДГ-3 указывает на преобладание процессов окисления малата и в целом на мобилизацию цикла трикарбоновых кислот. Таким образом, определение изоферментов МДГ в РЛС может служить показателем качества РЛС.

Выводы:

• 1.    В лекарственных растениях семейства Сложноцветные (одуванчике лекарственном, ромашке аптечной, тысячелистнике обыкновенном, календуле лекарственной, бессмертнике песчаном) выявлены две МФ фермента МДГ – МДГ-1 и МДГ-3.

• 2.    Динамика активности молекулярных форм МДГ в вышеуказанном ЛРС в условиях повышенной влажности носит индивидуальный характер и может быть использована как критерий подлинности и качества ЛРС.

• 3.    Полученные результаты могут быть использованы для составления нового регламента сушки и хранения лекарственного растительного сырья, а также нормативной документации для изготовления лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья.