Молекулярные вариации гена BTC1 Beta vulgaris L
Автор: Хуссейн Ахмад Садун, Михеева Наталья Ростиславовна, Черепухина Ирина Вячеславовна, Фомина Анастасия Сергеевна, Налбандян Арпине Артаваздовна
Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau
Рубрика: Агрономия
Статья в выпуске: 12, 2022 года.
Бесплатный доступ
Раннее цветение растений сахарной свеклы в первый год вегетации значительно снижает продуктивность культуры. Поэтому изучение и молекулярно-генетический отбор исходного материала, устойчивого к цветушности, является актуальным. Для изучения гена, контролирующего время цветения сахарной свеклы, были использованы листовые пластинки отечественных поддерживающих линий (О-тип) и зарубежных гибридов, отобранных в полевых условий, где проявлялся данный признак. При проведении полимеразно-цепной реакции в экспериментах применяли специфическую пару праймеров F9/R9. Обработка результатов секвенирования и сравнительный анализ проводился в программе Geneious Prime. В данной работе представлены результаты изучения гена BTC1 (bolting time control 1), регулирующего процесс цветения культуры Beta vulgaris L. Контроль происходит через регулирование деятельности двух генов, относящихся к семейству FT: ингибитора (Flowering Time 1) и активатора (Flowering Time 2) физиологического процесса - цветения. В генотипах, восприимчивых к цветушности, в гене BTC1 были обнаружены новые однонуклеотидные замены в экзоне 10, инициирующие замены в аминокислотном составе полипептидной цепи, что в итоге приводит к экспрессии функционально другого белка. Наличие определенных SNPs в гене BTC1 сахарной свеклы позволяет с высокой долей вероятности характеризовать те или иные генотипы как чувствительные к раннему цветению. Полученные экспериментальные данные позволяют на ранних этапах селекционного процесса отбирать генотипы, устойчивые к раннему цветению. Знания о генетической природе раннего цветения значимы при использовании культуры Beta vulgaris в разных географических поясах.
Сахарная свекла, цветушность, пцр-анализ, молекулярно-генетические маркеры, днк
Короткий адрес: https://sciup.org/140297463
IDR: 140297463 | DOI: 10.36718/1819-4036-2022-12-10-16
Текст научной статьи Молекулярные вариации гена BTC1 Beta vulgaris L
Введение. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) – ценная сельскохозяйственная культура, на долю которой приходится производство около 30 % мирового сахара. Перспективы дальнейшего развития и повышения эффективности селекции сельскохозяйственных культур связаны с развитием геномики, использующей для проведения геномных исследований новейшие методы молекулярной генетики [1]. У сахарной свеклы установлен ряд маркерных признаков, которые определяются отдельными генами или олигогенами и подчиняются менделевскому наследованию. К моногенным, нежелательным признакам относится, например, цветушность, или раннее стрелкование, присущее диким однолетним и рудеральным формам/видам свеклы. Локус В, координирующий ранний выход в стрелку без прохождения яровизации, был картирован на второй хромосоме, в области центромеры [2, 3]. Переход от вегетативного к генеративному росту в течение жизни цветкового растения запускается рядом генов вместе с эндогенными стимулами, а также сигналами окружающей среды, такими как изменение температуры или продолжительности светового дня. Для обеспечения оптимального репродуктивного успеха у цветковых растений существует разный жизненный цикл. Сахарная свекла – двулетнее растение, которое растет вегетативно в первый год и начинает уд- линение (стрелкование) побегов и цветение вследствие яровизации после зимы [4–6]. Обнаружено, что однолетность (закрепление без яровизации) контролируется геном BTC1 посредством регуляции двух генов-гомологов семейства FT – BvFT1 (репрессор цветения) и BvFT2 (индуктор цветения). В однолетней свекле преобладает аллель BTC1, который репрессирует BvFT1 и одновременно активирует BvFT2, чтобы вызвать побеги и цветение. Напротив, у двулетней свеклы экспрессия рецессивного аллеля BTC1 постепенно увеличивается до уменьшения активности BvFT1 во время яровизации, что позволяет стимулировать экспрессию BvFT2 для инициации цветения [7–10]. Толерантность к цве-тушности – важный признак сахарной свеклы. Перенос пыльцы от диких видов свеклы на участки получения семян влечет перемещение В-аллеля в возделываемые двухлетние растения свеклы. Чтобы понять факторы, контролирующие это свойство, мы изучали молекулярногенетические вариации гена BTC1, ключевого гена, связанного с одно- и двулетним жизненным циклом. Следовательно, молекулярная изменчивость (полиморфизм) BTC1 может быть мишенью для улучшения устойчивости культуры к цветушности. В настоящее время молекулярнобиологическими методами установлено, что слаженная работа вышеуказанных 2 генов осущест- вляется под строгим контролем гена-регулятора BTC1 (Bolting time control 1). Предполагается, что кодируемые им белки оказывают контролирующее воздействие на экспрессию генов BvFT1 и BvFT2. Доказано, что небольшие, но весьма значимые изменения в нуклеотидной последовательности BTC1 (SNPs) являются достаточным фактором, чтобы превратить однолетний генотип в двулетний [11–13].
Таким образом, создание устойчивых к цве-тушности гибридов сахарной свеклы является одной из важных и актуальных проблем в современной селекции.
Цель исследований – скрининг и детекция значимых мутаций в гене BTC1 .
Материалы и методы. Для изучения гена устойчивости к цветушности в качестве материалов были использованы листовые пластинки растения опылителя О-типа, отечественных и иностранных гибридов, отобранные в полевых условиях по проявлению данного признака.
Геномную ДНК выделяли с использованием стандартного протокола экстракции 7,5М ацетатом аммония [14, 15]. Качество экстрагированной НК оценивали электрофорезом в 2 % агарозном геле в 1 × TBE-буфере и определяли ее концентрацию с использованием набора для анализа ДНК HS QubitR (Thermo Fisher Scientific, США).
Для идентификации нуклеотидных последовательностей выполняли сравнение схожих последовательностей в базе данных NCBI. Дополнительный поиск генов и исследование их функций выполнены с использованием KAAS с параметрами по умолчанию [16]. Функции некоторых генов проверяли вручную, с использованием алгоритма BLAST (Basic local alignment search tool) [17].
Классическую полимеразно-цепную реакцию ставили в термоциклере SimpliAmp (Thermo
Fisher Scientific, США). Оптимизацию температуры отжига олигонуклеотидов проводили применяя метод температурного градиента. Реакцию амплификации проводили согласно следующему протоколу:
-
1: 94,0 °C в течение 4 мин (предварительная денатурация для активации «Hotstart» ДНК-полимеразы);
-
2: 94,0 °C в течение 30 с (денатурация в начале амплификационного цикла);
-
3: 58,0 °C в течение 1 мин 20 с (отжиг праймеров);
-
4: 72,0 °C в течение 1 мин 30 с (элонгация), количество циклов 30;
-
5: 72,0 °C в течение 5 мин (конечная элонгация).
Для обнаружения гена, контролирующего время цветения, в работе использовалась пара праймеров F.9/R.9, дизайн которых проводили в Primer BLAST (URL: primer-blast):
F.9 – 5, TGCAAGCAATCATGGGAGCA 3,
R.9 – 5, GTTTCCGGAATCGCGTTTGA 3,
Для регистрации продуктов ПЦР-ампли-фикации проводили аналитический электрофорез в 1,5 % агарозном геле c бромистым этидием. Визуализацию осуществляли под действием УФ-излучения на трансиллюминаторе Vilber (Франция). Секвенирование полученных продуктов амплификации осуществляли по методу Сэнгера на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500.
Результаты и их обсуждение. В результате проведенного ПЦР-анализа 5 селекционноценных образцов сахарной свеклы с использованием сконструированной нами пары праймеров F.9/R.9 у всех генотипов выявлен ожидаемый единичный бэнд, размером 1000 пн (рис. 1).

Рис. 1. ПЦР-амплификация генотипов свеклы с праймерами F.9/R.9:
1 – Медина (KWS, цветушное раст.); 2 – F 1 19153 (нецветушное раст.); 3 – РФ709 (нецветушное раст.); 4 – РМС127 (цвет. раст.); 5 – дикая свекла B. corolliflora Zoss.; М – маркер длин ДНК GeneRuler™ (Thermo Scientific, США); К- – (ПЦР-смесь без ДНК)
Среди генотипов, где обнаружен ПЦР-продукт, присутствуют как цветушные, так и не-цветушные растения. Объясняется это наличием в гене BTC1 определенных SNPs (однонуклеотидные замены), в данном случае в экзонах 9 и 10, что способствует преобразованию цветушно-го генотипа в нецветушный. Для точного подтверждения данного явления некоторые ампликоны (№ 3 и 4) были просеквенированы. Результаты прочтения нуклеотидных последовательностей части 9-го и 10-го экзонов отобранных образцов были проанализированы в программе Geneious Prime. В селекционном номере 4 (гибрид РМС 127) было подтверждено наличие известной однонуклеотидной замены – A/G, где присутствие аденина в данной позиции (10 экзон, 72) характерно для устойчивых генотипов [9]. Также в данных генотипах были выявлены новые SNPs в экзоне 10. На рисунке 2 представлен фрагмент генетического анализа по Сэнгеру, где наглядно продемонстрировано положение однонуклеотидных замен G/A в четырех позициях, а также в двух – A/G. При выравнивании нуклеотидных последовательностей интрона исследуемого генотипа с контрольным устойчивым генотипом с двулетним циклом развития (GenBank, Acc. No HQ709091.1) была выявлена вставка (insertion) длиной в 22 п.н. Для подтверждения того, что данная вставка в интроне может быть характерной для чувствительных генотипов, требуется изучение большого количества образцов, склонных к цветушности. Но изученный ранее нами гибрид Хамбер, характеризующийся проявлением цветушности, также содержал в интроне между 9-м и 10-м экзонами аналогичную вставку в 22 п.н., но с другой нуклеотидной последовательностью.

Рис. 2. Фрагмент локализации SNP s в 10-м экзоне и вставки/делеции в интронах образцов № 3 (101) и № 4 (117)
Не все SNPs являются интересными с точки зрения молекулярной биологии, так как многие из них могут относиться к так называемым synonymous SNP или нонсенс-мутациям и на выходе не менять аминокислотный состав белка. Лишь некоторые однонуклеотидные замены являются функционально значимыми (nonsynonymous), когда происходит замена аминокислоты в полипептидной цепи (в сравнении с нормой), в результате чего происходит экспрессия уже функционально другого белка. Из теоретического расчета в программе Geneious Prime следует, что только одна нуклеотидная замена не является ключевой (G/A – вторая по счету), так как не вносит изменения в аминокислотную последовательность пептида. Остальные 5 SNPs являются nonsynonymous и провоцируют замещение аминокислот. В двух случаях замен G/A (первая и третья по счету) вместо глицина синтезируется серин, шестая замена G/A способствует синтезу изолейцина вместо валина. Четвертая SNP (A/G) замещает треонин на аланин, а пятая SNP (A/G) – глутамин на аргинин (рис. 3).
Для селекции данные молекулярногенетические исследования очень актуальны и практически значимы. Они могут помочь селекционеру спрогнозировать вероятность проявления признака цветушности у разных генотипов. Знания о генетической природе раннего цветения полезны при использовании культуры Beta vulgaris в разных географических поясах.

Рис. 3. Дедуктивные аминокислотные последовательности, кодируемые полиморфными вариантами фрагмента экзона 10 гена BTC1: HQ709091.1 – контроль, нецветушный генотип; ген 101 ‒ № 3 (РФ709 нецветушное раст.); ген 117 ‒ № 4 (РМС 127 цветушное раст.)
Заключение. Результаты проведенного мо-лекулярного-генетического анализа свидетельствуют, что данные генотипы сахарной свеклы содержат в своем геноме полноценный ген, контролирующий работу двух генов-кандидатов цветушности ( FT1, FT2 ). В гибриде РМС-127 (№ 4) было подтверждено наличие известных SNP s в 10-м экзоне, характерных для цветуш-ных генотипов, и выявлены новые. В полевых условиях около 5 % растений данного гибрида проявляли цветушность в первый год вегетации. В растениях закрепителя стерильности О-типа РФ-709 не было выявлено данных однонуклеотидных замен. В поле растения данного генотипа не проявляли цветушности.
Это имеет важное теоретическое и практическое значение, так как позволяет на ранних этапах селекционного процесса выявлять генотипы со склонностью к цветушности. В дальнейшем будет продолжено изучение данного актуального вопроса для выявления всех значимых SNPs во всех десяти экзонах гена BTC1.
Список литературы Молекулярные вариации гена BTC1 Beta vulgaris L
- DNA molecular markers in plant breeding: cur-rent status and recent advancements in ge-nomic selection and genome editing. Review / M. Nadeem [et al.] // Biotechnology & Biotech-nological equipment. 2018. Vol. 32. No. 2. P. 261–285. DOI: 10.1080/13102818.2017. 1400401.
- High resolution mapping of the bolting gene B of sugar beet / A. El-Mezawy [et al.] // Theor Appl Genet. 2002. Vol. 105. P. 100–105. DOI: 10.1007/s00122-001-0859-z.
- A bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugar beet and physical map comprising the bolting gene B / U. Hohmann [et al.] // Mol Gen Genom. 2003. Vol. 269. P. 126-136. DOI: 10.1007/s00438-003-0821-7.
- Sugar beet (Beta vulgaris L.) / H. Kagami [et al.] // Methods Mol Biol. 2015. P. 335–347. DOI: 10.1007/978-1-4939-1695-5_27.
- Two CONSTANS-LIKE genes jointly control flowering time in beet / N. Dally [et al.] // Sci Rep. 2018. Vol. 8:16120. DOI: 10.1038/ s41598-018-34328-4.
- Gauley A., Boden S. Stepwise increases in FT1 expression regulate seasonal progression of flowering in wheat (Triticum aestivum) // New Phytologist. 2021. V. 229. P. 1163–1176. DOI: 10.1111/nph.16910.
- Genetic analysis of bolting after winter in sugar beet (Beta vulgaris L.) / N. Pfeiffer [et al.] // TheorAppl Genet. 2014. Vol. 127. P. 2479–2489. DOI: 10.1007/s00122-014-2392-x.
- A detailed analysis of the BR1 locus suggests a new mechanism for bolting after winter in sugar beet (Beta vulgaris L.) / C. Tränkner [et al.] // Front. Plant Sci. 2016. Vol. 7:1662. DOI: 10.3389/fpls.2016.01662.
- Haplotype Variation of Flowering Time Genes of Sugar Beet and Its Wild Relatives and the Impact on Life Cycle Regimes / N. Höft [et al.] // Front Plant Sci. 2018. Vol. 8:2211. DOI: 10.3389/fpls.2017.02211.
- Transcriptomic study of the night break in Chenopodium rubrum reveals possible up-stream regulators of the floral activator CrFTL1 / D. Guti´errez-Larruscain [et al.] // Journal of Plant Physiology. 2021. V. 265. Arti-cle 153492.
- The Role of a Pseudo-Response Regulator Gene in Life Cycle Adaptation and Domestica-tion of Beet / P. Pin [et al.] // Current Biology. 2012. Vol. 22. P. 1095–1101. DOI: 10.1016/j. cub.2012.04.007.
- Höft N., Dally N., Jung Ch. Sequence variation in the bolting time regulator BTC1 changes the life cycle regime in sugar beet // Plant Bree-ding. Original article. 2018. Vol. 137. P. 412–422. DOI: 10.1111/pbr.12579.
- Validation of suitable genes for normalization of diurnal gene expression studies in Chenopodium quinoa / N. Maldonado-Taipe [et al.] // PLoS ONE. 2021. V. 16 (3). DOI: 10.1371/journal.pone.0233821.
- Development of an Ammonium Sulfate DNA Extraction Method for Obtaining Amplifiable DNA in a Small Number of Cells and Its Application to Clinical Specimens / S. Young [et al.] // BioMed Research International. 2013. Article ID 546727:1-10. DOI: 10.1155/2013/546727.
- Efficient and nontoxic DNA isolation method for PCR analysis / A.S. Hussein [et al.] // Rus-sian Agricultural Sciences. 2014. No 40 (3). P. 177–178.
- KAAS: an automatic genome annotation and pathway reconstruction server / Y. Moriya [et al.] // Nucleic Acids Research. 2007. Vol. 35. P. 182–185. DOI: 10.1093/nar/gkm321.
- Basic local alignment search tool / S. Altschul [et al.] // Journal of molecular biology. 1990. Vol. 215(3). P. 403–410. DOI: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.