Мониторинг посттрансплантационного химеризма методом Indel ПЦР в реальном времени

Введение. Успех аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) во многом определяется взаимодействием трансплантата и организма реципиента. Нежелательными клиническими проявлениями такого взаимодействия являются «реакция трансплантат против хозяина», развитие посттрансплантационного рецидива, отторжение и др. Мониторинг химеризма после аллогенной ТГСК важен для оценки эффективности транс-плантации,выявления ранних рецидивов и своевременной коррекции терапии. В настоящее

время для определения маркеров донорского химеризма применяют как традиционные (скрининг антигенов эритроцитов АВО, Резус и др.), так и классические (цитогенетические или молекулярно-генетические). Определение полиморфизма InDel-локусов с использованием количественной ПЦР является наиболее чувствительным методом оценки донорского химеризма.

Цель исследования. Апробировать и внедрить в клиническую практику методику мониторинга посттрансплантационного химеризма методом InDel ПЦР в реальном времени.

Материалы и методы . Исследование включало 26 онкогематологических больных, для всех из них был подобран потенциальный родственный/неродственный донор; для 21 из них была проведена аллогенная ТГСК (для 13 — родственная, для 8 — неродственная). Материалом для исследования служили биологические образцы пациентов и доноров — периферическая кровь и костный мозг. Сортировку клеточных линий (CD34+; CD3+) осуществляли с использованием магнитных частиц,конъю-гированных с антителами к соответствующим маркерам (Dynabeads, Thermo Fisher Scientific). Препараты ДНК для оценки уровня химеризма были получены методом колоночной фильтрации с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAgen, Германия). Оценку уровня химеризма проводили методом InDel ПЦР в реальном времени с использованием панели,состоящей из 25 полиморфизмов и одного референсного гена. Для проведения количественной ПЦР в режиме реального времени в качестве флуоресцентной метки зонда использовали 5´-FAM, в качестве гасителя флуоресценции зонда — 3´-RTQ. Детекцию сигнала проводили на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия).

Результаты . В ходе проведенного исследования установлено, что для всех 26 пар донор-реципиент были найдены информативные маркеры: не менее трех для родственных алло-ТГСК и не менее шести для неродственных.

Санкт-Петербург 30-31 мая 2019 г.

Информативность каждого маркера была подтверждена с использованием классической ПЦР и ПЦР в реальном времени. Все маркеры по частоте встречаемости в качестве информативных были разделены на высокоинформативные (частота информативности более 10 %) — 7 маркеров, среднеинформативные (частота информативности от 5 до 10 %) — 14, низкоинформативные (частота информативности менее 5 %) — 4. Это позволит в дальнейшем сократить материальные затраты на этап поиска информативных маркеров пар донор-реципиент за счет сокращения панели анализируемых полиморфизмов до высокоинформативных. Нами было проведено сравнение эффективности ПЦР идентичного информативного маркера для 5 пациентов. Полученные результаты свидетельствуют о том,что эффективность прохождения ПЦР варьируется в зависимости от пары донор-реципиент, и при необходимости значение эффективности ПЦР должно быть рассчитано для каждого случая отдельно. За период с января 2018 по март 2019 года была проведена количественная оценка уровня линейного (CD3+, CD34+) и общего химеризма для 21 пациента клиники Учреждения. У двух из них наблюдался рецидив заболевания, у одного — неприживление трансплантата;во всех случаях уровень собственных клеток реципиента превышал 90 %.

Выводы . 1. За период с января 2018 по март 2019 апробирована и внедрена в клиническую практику Учреждения методика мониторинга посттраснплантационного химеризма методом InDel ПЦР в реальном времени. 2. Сформированная панель биомаркеров имеет высокую степень информативности для пар донор-реципиент нашего региона. 3. Внедренная методика обладает высокой чувствительностью и точностью при уровнях химеризма до 10 % и выше 90 %, в остальных случаях целесообразно использовать другие методики,например, STR-ПЦР.