Морфофизиологические и биохимические показатели каллусов у сортообразцов озимой тритикале (x Triticosecale wittmack) при засолении

Тритикале (½ Triticosecale Wittmack) — зерновая культура, гибрид пшеницы (Triticum) и ржи (Secale), сочетающая такие ценные признаки, как высокая продуктивность, кормовая питательность, сбалансированность зерна по составу минеральных веществ (1, 2). Культура проявляет устойчивость к некоторым болезням и вредителям мягкой пшеницы, в том числе ржавчине, септориозу, стеблевой и твердой головне, мучнистой росе (3, 4). Эти ценные свойства имеют важное значение для ее использования в сельскохозяйственном производстве. Актуальным представляется исследование солеустойчивости тритикале, которая в целом изучена недостаточно (5, 6). Работы в этом направлении, а также выявление устойчивых образцов особенно важны в связи с распространением засоленных почв в районах возделывания тритикале, в частности в Дагестане (7).

Среди методов изучения и диагностики устойчивости растений к стрессовым воздействиям все больше внимания привлекают биотехнологические (8-10). Изолированные клетки и ткани широко применяются для изучения и диагностики устойчивости растений к пониженным температурам (11), избытку алюминия (12), засухе (13, 14), засолению (15-17), загрязнению тяжелым металлам (18, 19), биотическим (20-22) и многим другим факторам. Это удобная и перспективная модельная система для анализа механизмов формирования и возможностей повышения стрессоустойчивости (23-25). Привлекает внимание сравнительный анализ влияния стрессоров, в том числе тяжелых металлов (20) и засоления (8), in vitro и in vivo.

Применение культур изолированных клеток при анализе солеустой-чивости позволяет выявлять молекулярные механизмы и физиолого-биохимические основы изучаемых процессов (26-28). Исследования солеустойчи-вости in vitro направлены на отбор устойчивых видов и сортов (29), разработку методов диагностики и схем клеточной селекции (30, 31), сопоставление с интактными растениями (32).

Важным представляется накопление экспериментальных данных in vitro с целью отбора сортов зерновых культур, устойчивых к засолению (33, 34). Однако для тритикале сведения о сортовой специфике каллусообразо-вания в условиях солевого стресса, ростовых особенностях каллусных культур и изменениях их биохимических параметров практически отсутствуют. Информация о маркерах окислительного стресса (содержание малонового диальдегида — МДА, активность пероксидазы и каталазы) в условиях засоления относится к интактным растениям тритикале (5, 6), а вопросы, связанные с анализом физиолого-биохимических изменений в культивируемых in vitro тканях тритикале, остаются слабо изученными.

Пролин — наиболее известный осмолит, который накапливается в растениях при действии абиотических факторов (35, 36). Повышенное накопление пролина может служить индикатором стресса, а степень и кратность его повышения при стрессе — основным критерием солеустойчивости генотипов и показателем их адаптивности к стрессовому воздействию (3739). Распространенным и удобным методом оценки интенсивности окислительного стресса у растений и структурной целостности мембран служит измерение количества МДА — продукта перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. В последнее время появляется все больше данных, показывающих, что увеличение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) при стрессе становится не только следствием нарушения перекисного гомеостаза, но и представляет собой важный компонент адаптационного процесса (40-42).

В представленной работе впервые выявлена зависимость активности каллусообразования, прироста сырой и сухой биомассы, динамики накопле- ния в тканях пролина и интенсивности ПОЛ от концентрации соли NaCl (0,5; 0,75 и 1 %) в питательной среде, а также сортовая специфика изменения этих показателей в условиях засоления у образцов озимой тритикале.

Целью работы было изучение влияния разной степени хлоридного засоления на морфофизиологические и биохимические изменения каллусов пяти сортообразцов озимой тритикале.

Методика. Опыты проводили в 2014-2016 годах в Дагестанском государственном университете. В качестве материала для исследований использовали зрелые зародыши зерновок сортообразцов озимой тритикале Triskell, Сотник, ПРАГ530л-1934, Timbo и Алмаз из коллекции Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова.

Для введения в культуру in vitro зерновки последовательно стерилизовали в течение 30 с в 96 % в этаноле и 20 мин — в коммерческом препарате Белизна (АО «Каустик», Россия), затем 3 раза по 5 мин промывали стерильной дистиллированной водой. Выделенные из поверхностно простерилизованных зерновок зародыши помещали на питательную среду срезом вниз для формирования каллуса. Питательные среды стерилизовали в автоклаве (2540 EKA, «Tuttnauer», Израиль) при 121 ° С в течение 20 мин и разливали по чашкам Петри, предварительно простерилизован-ным сухим жаром. В работе использовали четыре варианта питательной среды Мурасиге-Скуга (МС), которые различались по концентрации NaCl: МС с добавлением 2,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4Д) и 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) (контрольный вариант, МС1); МС + 2,4-Д + БАП + 0,5 % NaCl (МС2); МС + 2,4-Д + БАП + 0,75 % NaCl (МС3); МС + 2,4-Д + БАП + 1 % NaCl (МС4).

Продолжительность культивирования зрелых зародышей на питательных средах составляла 30 сут. Объем выборки — 25 зародышей каждого сорта в 3-кратной повторности для каждого варианта. Зародыши во всех вариантах культивировали в климатической камере (MLR-352H, «Sanyo», Япония) в условиях 16-часового фотопериода при 24±1 ° С, освещенности 3000 лк и влажности 80 %.

Определяли размер каллусов, прирост сырой и сухой биомассы, накопление свободного пролина (43), интенсивность процессов перекисного окисления липидов (44). Размер каллуса (длина) измеряли с помощью линейки. Свежую и сухую биомассу оценивали гравиметрическим методом с помощью аналитических весов (ВСЛ-60/0,1А, «Невские весы», Россия). Сухую массу определяли после фиксации материала при 105 ° С в течение 3 ч и при доведении до постоянной массы.

Количество свободного пролина определяли по методу L.S. Bates с соавт. (43). Навеску массой 100 мг растирали в 5 мл дистиллированной воды (2 мл + 2 мл + 1 мл). Содержимое пробирки кипятили в течение 1015 мин и охлаждали на ледяной бане, затем центрифугировали 20 мин при 6 тыс. об/мин (центрифуга ОПН-8, ОАО «ТНК «Дастан», Киргизия). Из образовавшейся вытяжки брали по 2 мл экстракта и переносили в чистые пробирки. К 2 мл экстракта добавляли 2 мл нингидринового реактива (1,25 г нингидрина + 20 мл 6 М Н3PO4 + 30 мл ледяной уксусной кислоты) и 2 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирки с полученным раствором тщательно перемешивали и инкубировали в течение 60 мин на кипящей водяной бане, после чего охлаждали на ледяной бане. В контрольном образце вместо экстракта добавляли 2 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряли при X = 520 нм (спектрофотометр ПЭ-5400УФ, ООО «ЭКРОСХИМ», Россия). Содержание пролина рассчитывали по калибровочной кривой.

Интенсивность перекисного окисления липидов в каллусах сортооб-разцов тритикале определяли по накоплению в тканях продукта окисления липидов (МДА) по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (44) при высокой температуре и кислом значении рН, что приводит к образованию окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы ТБК (44). Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре при λ = 540 нм. Содержание МДА рассчитывали по формуле: С = OD ½ V/ ε ½ L ½ 1000 ½ P, где С — концентрация МДА, мкМ; OD — оптическая плотность при λ = 540 нм; ε — коэффициент молярной экстинкции МДА (155 мМ ^{- 1}•см ^{- 1}); L — длина пути светового пучка в кювете с раствором (1 см); V — объем среды для растирания навески, мл; P — навеска растительного материала, г.

Эксперименты проводили в 3 биологических повторностях. Для оценки содержания свободного пролина и ПОЛ в каждом варианте для анализа использовали по 3 пробы в 4 аналитических повторностях.

Данные обрабатывали в программе Microsoft Excel 2007. Рассчитывали средние значения изучаемых параметров ( М ), стандартные отклонения среднего (±SD) и стандартные ошибки средних значений (±SEM). Для сравнения независимых выборок использовали параметрический t -критерий Стьюдента. Различия между вариантами считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты. В таблицах 1-3 указано число полученных каллусов.

На питательной среде МС + 2,4-Д + БАП с низким содержанием соли (0,5 % NaCl, МС2) между сортообразцами тритикале уже наблюдались различия в размерах каллуса: минимальное уменьшение размера относительно контроля отмечали у образца Triskell (в 1,1 раза, р < 0,05), наибольшее — у Timbo (в 1,7 раза, р < 0,05).

Рис. 1. Размер каллусов у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова) в зависимости от концентрации NaCl в питательной среде: а — Triskell, б — Timbo, в — Алмаз, г — Сотник, д — ПРАГ530л-1934 (измерения проводили в 3 биологических повторностях, фактический размер выборок см. в таблице 1, M ±SEM).

* Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

Добавление в среду хлорида натрия в концентрации 0,75 % (МС3) приводило к снижению размера каллуса у сортообразцов Triskell, Сотник и ПРАГ530л-1934 соответственно в 1,8; 1,9 и 2,0 раза относительно контроля (р < 0,05), у сортообразцов Timbo и Алмаз каллусогенез полностью подавлялся (рис. 1). На питательной среде МС4 с 1 % NaCl каллус формиро- вался только у образца Triskell, при этом размер каллуса снижался в 2,9 раза (р < 0,05) (см. рис. 1).

1. Общее число полученных каллусов при определении их размера и биомассы у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилов) в зависимости от концентрации NaCl в питательной среде (3 биологические повторности)

Образец	Контроль         0,5 %          0,75 %            1 %
Triskell Timbo Алмаз ПРАГ530л-1934 Сотник	73                  66                  56                   13 66                  54                   0                   0 67                  56                   0                   0 70                  62                  51                    0 71                  64                  49                    0

В варианте более слабого засоления МС2 наименьшее снижение сырой биомассы каллуса происходило у образцов Triskell (в 1,6 раза относительно контроля, р < 0,05) и Алмаз (в 1,7 раза, р < 0,05), наибольшее — у Timbo (в 3,0 раза, р < 0,05). На питательной среде МС3 у образцов Алмаз и Timbo процесс каллусообразования полностью подавлялся. У сортообразцов Triskell, ПРАГ530л-1934 и Сотник сырая биомасса снижалась относительно контроля соответственно в 2,1; 2,5 и 2,5 раза (р < 0,05) (рис. 2). В варианте МС4 у устойчивого образца Triskell сырая биомасса составила 31 % относительно контроля (р < 0,05). У остальных сортообразцов в этом варианте каллусообразования не отмечали.

Концентрация NaCl. %

Рис. 2. Сырая (А) и сухая (Б) биомасса каллусов у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) из коллекции Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова в зависимости от концентрации в питательной среде NaCl: а — Triskell, б — Timbo, в — Алмаз, г — Сотник, д — ПРАГ530л-1934 (измерения проводили в 3 биологических повторностях, фактический размер выборок см. в таблице 1, M ±SEM).

*Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

По накоплению сухой биомассы в варианте МС2 высокие показатели имели образцы Triskell и Сотник (62 и 57 % по отношению к контролю, р < 0,05). На питательной среде МС3 наибольшую сухую биомассу каллусов отмечали у Triskell (43 %), наименьшую — у образцов ПРАГ530л-1934 (23 %) и Сотник (25 %). У сортообразцов Алмаз и Timbo в этих условиях каллусо-образования не наблюдали. При добавлении в питательную среду NaCl в самой высокой концентрации (МС4) у образца Triskell сухая биомасса составила 21 % относительно контроля (р < 0,05), тогда как у остальных сорто-образцов процесс каллусообразования полностью подавлялся. Это свидетельствует о большей устойчивости образца Triskell (см. рис. 2).

В работах других авторов сообщалось о снижении каллусогенеза на среде с добавлением NaCl у гибридных линий пшеницы, выведенных в условиях Северо-Казахстанской области. Существенное (почти 10-кратное) ингибирование каллусообразования было отмечено на среде с 50 мМ (0,29 %) NaCl (34). Культивирование зародышей пшеницы на питательной среде МС с добавлением соли NaCl (100 мМ, 0,6 %) приводило к снижению массы каллуса по сравнению с контрольным вариантом (31). С увеличением концентрации NaCl на среде МС до 1,5 % отмечалось снижение ростовых показателей и биомассы у каллусов пшеницы (32). Разрабатывая схему клеточной селекции для сортов твердой и мягкой пшеницы, исследователи показали, что засоление в варианте 0,4 % NaCl оптимально для мягкой селекции, а сублетальная концентрация соли 1 % (в наших опытах ей соответствовал вариант МС4), которая приводит к многократному снижению частоты регенерации растений из каллусных культур, — для жесткой (33, 45).

Рис. 3. Содержание свободного пролина в каллусах у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова) в зависимости от концентрации в питательной среде NaCl: а — Triskell, б — Timbo, в — Алмаз, г — Сотник, д — ПРАГ530л-1934 (измерения проводили в 3 биологических и 4 аналитических повторностях, фактический размер выборок см. в таблице 2, M ±SEM).

* Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

На 30-е сут мы определяли содержание пролина в каллусах, подвергнутых солевому стрессу (рис. 3). Установлено, что сортообразцы озимой тритикале различались по этому показателю уже в контрольном варианте: наибольшее содержание пролина отмечали у чувствительных образцов Timbo (6,5 мкмоль/г сырой массы) и Алмаз (7,4 мкмоль/г), наименьшее — у устойчивых Triskell (5 мкмоль/г), Сотник (5,5 мкмоль/г) и ПРАГ530л-1934 (5,9 мкмоль/г). На питательной среде с NaCl каллусы устойчивых по биометрическим показателям сортообразцов выделялись морфогенной структурой и были способны к побегообразованию и высокому накоплению пролина (см. рис. 3).

2. Общее число полученных каллусов при определении содержания свободного пролина у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилов) в зависимости от концентрации NaCl в питательной среде (3 биологические повторности)

Образец	Контроль	0,5 %	0,75 %	1 %
Triskell	70	68	55	15
Timbo	64	54	0	0
Алмаз	67	52	0	0
ПРАГ530л-1934	71	63	48	0
Сотник	69	58	49	0

При введении NaCl в среду у каллусов чувствительных образцов наблюдалось потемнение и отмирание участков тканей. У наиболее чувствительного сортообразца Timbo это проявлялось уже на питательной среде МС2, у других (Сотник, ПРАГ530л-1934) — на МС4 (см. рис. 3). В варианте МС1 количество пролина у чувствительных образцов Timbo и Алмаз составило 6,5 и 7,4 мкмоль/г сырой массы. Добавление NaCl в питательную среду в концентрации 0,5 % (МС2) повышало содержание пролина в каллусах у сортообразцов Timbo и Алмаз соответственно в 3,3 и 3,5 раза (р < 0,05) относительно контроля. В варианте МС3 у этих образцов процесс каллусообразования не наблюдался. У устойчивого образца Triskell при всех изученных концентрациях было зафиксировано высокое содержание пролина: при добавлении в среду NaCl в концентрациях 0,5; 0,75 и 1 % оно повышалось соответственно в 4,9; 6,2 и 6,9 раза (р < 0,05) (см. рис. 3).

Большинство исследователей отмечают, что в каллусах зерновых культур при засолении наблюдается изменение содержания пролина. Действие абиотических стрессов на сельскохозяйственные растения приводит к высокому накоплению пролина, что коррелирует с их стрессоустойчиво-стью (46). У сортов Durakli и Careioglu ( Triticum dicoccum Schrank ex Schubl.) в каллусах содержание пролина повышалось при концентрациях NaCl 50 мМ, 100 мМ и 250 мМ. При увеличении концентрации NaCl до 250 мМ (1,5 %) устойчивый сорт Careioglu характеризовался высоким содержанием пролина, чувствительный сорт Durakli — низким (47). Солевой стресс вызывал накопление пролина в каллусах у устойчивых сортов ячменя (48).

Рис. 4. Содержание малонового диальдегида в каллусах у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова) в зависимости от концентрации в питательной среде NaCl: а — Triskell, б — Timbo, в — Алмаз, г — Сотник, д —

ПРАГ530л-1934 (измерения проводили в 3 биологических и 4 аналитических повторностях, фактический размер выборок см. в таблице 3, M ±SEM).

• * Различия с контролем статистически значимы при р < 0,05.

• 3.    Общее число полученных каллусов при определении содержания малонового диальдегида у сортообразцов озимой тритикале ( х Triticosecale Wittmack) (коллекция Дагестанской опытной станции — филиала ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилов) в зависимости от концентрации NaCl в питательной среде (3 биологические повторности)

  Образец	Контроль	0,5 %	0,75 %	1 %
  Triskell	71	68	56	12
  Timbo	67	53	0	0
  Алмаз	67	50	0	0
  ПРАГ530л-1934	73	65	51	0
  Сотник	70	62	53	0

Интенсивность ПОЛ, которую оценивают по содержанию МДА, часто рассматривается как показатель наличия или отсутствия стрессовой реакции в растениях (40). В нашем опыте в каллусах сортообразцов озимой тритикале, подвергнутых воздействию NaCl, содержание МДА было выше, чем в контрольном варианте. У устойчивых образцов тритикале в условиях засоления количество МДА в каллусах уменьшалось, у чувствительных — увеличивалось (рис. 4).

На питательной среде МС2 у чувствительных сортообразцов Алмаз и Timbo содержание МДА повышалось соответственно в 1,4 и 1,5 раза (р < 0,05) относительно контроля (0,017 мкмоль/г сырой массы). У устойчивого образца Triskell накапливалось меньше всего МДА: в варианте МС2 его содержание повышалось в 1,1 раза (р < 0,05) (до 0,019 мкмоль/г), на питательной среде МС3 — в 1,3 раза (р < 0,05) (до 0,022 мкмоль/г). При добавлении в среду 1 % NaCl (МС4) количество МДА увеличивалось в 1,4 раза (р < 0,05) (до 0,024 мкмоль/г) (см. рис. 4). При введении в питательную среду NaCl в концентрации 0,5 % у образца Сотник количество МДА возрастало в 1,2 раза (р < 0,05) (до 0,021 мкмоль/г сырой массы), в варианте МС3 — в 1,5 раза (р < 0,05) (до 0,026 мкмоль/г).

В каллусах устойчивых сортообразцов озимой тритикале в условиях засоления содержание МДА было низким, что может свидетельствовать о меньшей степени повреждения клеточных мембран (32).

Сортовая специфика накопления продуктов ПОЛ в условиях засоления отмечена и в других работах. Например, при добавлении в питательную среду 100 мМ NaCl (0,6 %) интенсивность ПОЛ у кунжута коррелировала с относительной сортовой толерантностью (36). У сортов T. dicoccum Durakli и Careioglu в условиях солевого стресса (0,3 и 0,9 % NaCl) количество МДА увеличивалось по сравнению с контролем, в меньшей степени — у устойчивого сорта Careioglu (47). При введении в среду Мурасиге-Скуга NaCl в концентрации 100 мМ (0,6 %) у сортов томата в каллусах повышалось содержание МДА: устойчивый сорт PS-10 характеризовался низким накоплением МДА (увеличение количества в 1,78 раза по сравнению с контролем, р < 0,05), чувствительный сорт Roma — высоким (увеличение в 2,16 раза, р < 0,05) (49).

Таким образом, наши эксперименты показали влияние NaCl на ростовые и биохимические показатели каллусов у пяти сортообразцов озимой тритикале из коллекции Дагестанской опытной станции (филиал ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова). Выраженное уменьшение размера и биомассы каллусов в условиях стресса наблюдалось у образцов Timbo и Алмаз (соответственно 4,6 и 6,4 мм, 29,0 и 67,5 мг, р < 0,05). При добавлении в среду 0,75 % NaCl формирование каллуса у них было полностью подавлено. На питательной среде с высоким содержанием соли (1 % NaCl) каллусообразование происходило только у устойчивого сортообразца Triskell, а у чувствительного сортообразца Timbo каллус формировался только на питательной среде с добавлением 0,5 % NaCl. В условиях засоления образцы озимой тритикале, проявившие устойчивость при оценке ростовых показателей каллусов (Triskell, Сотник и ПРАГ530л-1934), характеризовались высоким накоплением в каллусах пролина (соответственно 30,9; 28,4 и 30,2 мкмоль/г, р < 0,05) и низким содержанием малонового диальдегида (0,022; 0,026 и 0,025 мкмоль/г, р < 0,05). Полученные данные могут быть использованы при изучении механизмов устойчивости тритикале и других злаковых культур к засолению в условиях in vitro, в селекционной работе при отборе устойчивых образцов, а также при подборе сортов для выращивания на засоленных почвах. Сорта с высокими показателями можно рекомендовать для возделывания на засоленных территориях Дагестана и других регионов России.