Морфофункциональная характеристика костной ткани в условиях экзогенной интоксикации в эксперименте у крыс

DOI:

Особенностью костной ткани является относительно небольшое количество клеток всего двух специализированных популяций и

небольшое число сосудов, в то время как ее основные функциональные свойства в основном определяются наличием органического и минерального внеклеточного матрикса [1; 9; 19; 23]. Нормальное функционирование ко- стной ткани обеспечивается равновесием процессов восстановления и разрушения, поддерживаемых специализированными клетками, их рецепторами и сигнальными молекулами [16; 17; 25].

Постоянное обновление (ремоделирование) матрикса кости требует комплексной деятельности остеобластов, остеоцитов и остеокластов, которая регулируется достаточно сложным комплексом нервных, иммунных и эндокринных механизмов [3; 24; 27]. В процессе жизнедеятельности в организме аккумулируются токсические соединения, избыток которых способен вызывать негативные последствия для нормального течения восстановительных процессов в костной ткани, также проявляющихся в органах-мишенях, таких как почки, печень, легкие [6; 8]. Процесс ремоделирования кости напрямую связан с функцией печени и почек, которые относятся к основным органам, вовлеченным в детоксикацию и часто повреждаемых токсинами [8; 30].

Следовательно, неблагоприятное воздействие факторов химической природы, помимо прямого воздействия на клетки костной ткани, может нарушать механизмы регуляции и метаболического обеспечения этого процесса, что в совокупности должно сопровождаться нарушением строения и свойств кости [8]. Длительно существующее токсическое прямое или косвенное воздействие на костную ткань и ее физиологические механизмы способно спровоцировать системные патологические изменения. В то же время исследование костной ткани до настоящего времени не относится к типичным процедурам для индикации неблагоприятного воздействия на организм химических факторов внешней среды [12].

Для активной регенерации костной ткани необходимо сочетание ряда восстанавливающих мероприятий [14; 15; 18; 26]. Здесь не только важны подходы, основанные на базовой терапии исключительно костной ткани, но и требуется разработка комплексного подхода, основанного на восстановлении систем детоксикации в организме. Восстановление системных отрицательных изменений, вызванных токсическим действием, даст преимущество в успешности имплантации в области стоматологии и ортопедии [31].

Применение специальных регенеративных методов костной инженерии, основанных на использовании биомиметических нанокомпозитов и покрытий, оказало существенное положительное воздействие на процесс остеоинтеграции внутрикостных имплантатов [4; 11; 14; 20; 29]. В современной клинической практике уже используются имплантационные конструкции с уникальными биологическими и функциональными покрытиями и наноматериалами для обеспечения долговечности и надежности остеоинтеграции [10; 13; 22; 28]. Для усовершенствования регенерации костной ткани при имплантации разрабатываются новые биомиметические органические и неорганические составы [2; 5; 7; 21].

Цель работы – изучить морфофункциональные изменения костной ткани в условиях введения экзогенных токсинов.

Материалы и методы

Исследование проводилось на 15 крысах-самцах линии Wistar массой 200–250 г. Работа с животными проводилась в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях. Выведение животных осуществляли с помощью введения 10-кратной дозы «Рометар» (Россия) (0,4 мл/кг массы животного).

При моделировании дегенеративных изменений костной ткани крысы оценивались через 30 суток, после чего проводили сравнение с группой интактных животных. В первой серии эксперимента хроническую интоксикацию воспроизводили пероральным введением тетрах-лорметана из расчета 0,5 мл/кг массы в виде 30 %-ного масляного раствора через день (серия ТХМ). Во второй серии эксперимента использовали с той же частотой внутрибрюшинные инъекции нефротоксичного антибиотика гентамицина (серия ГМ) из расчета 20 мг/кг массы. Животных выводили из опыта по 5 особей на 30-е сутки после начала эксперимента. 5 крыс составили группу интактных животных.

Гистологические препараты костной ткани приготавливали после фиксации в 10 %-ном растворе нейтрального забуференного формалина и декальцинации в растворе «Cal-Ex®» (Fisher Scientific, США), окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных антител к маркеру клеток остеогенного ряда остеонектину (NCL O-nectin, 15G12, Novocastra, Великобритания), маркеру макрофагов и остеокластов CD-68 (Novocastra, Великобритания), металлопротеиназе MMP-9 (клон MMP9-439, Leica Mycrosystems, Германия) и ее ингибитору TIMP-1 (клон VT7, Dako Cytomation, Дания). Фотосъемка сочеталась с количественным морфологическим исследованием и была проведена с помощью аппаратного комплекса «ToupView» (США). Он включал в себя бинокулярный исследовательский микроскоп «Микомед-5» (Россия), цифровую камеру «ToupCam» (США), компьютер с цветным принтером высокого разрешения и программным обеспечением «ToupView», «ImageJ версия 1.48v» (США).

Морфометрическое исследование проводилось по общепринятым принципам системного количественного анализа. В работе была проанализирована средняя толщина кортикального слоя кости (мкм), костных трабекул (мкм), объемная доля костной ткани ( %). Подсчитывали численную плотность костных и иммунопозитивных клеток (1/мм3) [23].

Количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США) с расчетом показателей, принятых для характеристики непараметрических выборок в медико-биологических исследованиях (медиана [1-й квартиль ^ 3-й квартиль]). Для доказательства достоверности различий применен дисперсионный анализ с использованием непараметрического критерия Фридмана для множественных групп ( p < 0,01).

Результаты и их обсуждение

Результаты морфометрии костной ткани у крыс в условиях введения экзогенных токсинов у первой и второй опытной серии, а также группы интактных животных приведены в таблице 1.

В результате введения токсинов наблюдается снижение толщины кортикального слоя кости на 30-е сутки эксперимента на 60 % и 80 % по сравнению с интактными животными. Также наблюдается разница между ТМХ и ГМЦ, что позволяет предположить, что влияние токсинов на функциональное состояние почек значительнее сказывается на усилении процессов резорбции костной ткани. При этом объемная доля костной ткани возрастала в обеих опытных сериях по сравнению с контролем при введении ТМХ в 1,04 раза, а при введении ГМЦ – в 1,32 раза (p < 0,05). Толщина трабекул через 30 суток после введения экзотоксинов не изменялась в опытных сериях в сравнении с интактными животными. Численная плотность клеток костной ткани уменьшилась на 30-е сутки в 1,07 раза (p < 0,05) при введении ТМХ, при введении ГМЦ достоверных изменений не происходило. В результате эксперимента значительно увеличилась численная плотность остеокластов и макрофагов CD-68 по сравнению с интактной группой при интоксикации ГМЦ в 2,75 (p < 0,05) раза, что свидетельствует о том, что поражение почек приводит к увеличению остеокластов в костной ткани, запускающих интенсивную резорбцию кости.

Результаты полуколичественного определения синтетической активности остеобластов и остеокластов костной ткани после интоксикации ТМХ и ГМЦ показали следующие результаты, представленные в таблице 2.

Синтетическая активность остеобластов и остеокластов изменяется на 30-е сутки эксперимента по сравнению с интактными животными. Индекс синтетической активности остеонектина снизился в 1,21 раза при введении ТМХ, а при введении ГМЦ – в 1,63 раза ( p < 0,05). Такое снижение остеонектина связано с увеличением синтеза MMP-9 остеокластами, численная плотность которых увеличивалась к концу эксперимента в 1,68 (ТМХ) и 1,42 (ГМЦ) раза ( p < 0,05) по сравнению с интактными животными. В результате усиления резорбции костной ткани снизилась синтетическая активность ТИМП-3 при введении ТМХ в 2,03 раза, а ГМЦ – в 1,36 раза ( p < 0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при интоксикации развивается дисбаланс процессов, обеспечивающих восстановление костной ткани: на фоне уменьшения остеосинтетических процессов в ткани значи-

Таблица 1

Морфометрические показатели костной ткани интактных крыс и при введении экзотоксинов (Me [1-й квартиль ^ 3-й квартиль])

Показатель	Интактные животные	Сроки эксперимента – 30 суток
		ТМХ	ГМЦ
Толщина кортикального слоя кости, мкм	75,75 [70,73 ÷ 83,29]	47,75*# [22,70 ÷ 57,71]	19,91*# [8,84 ÷ 28,14]
Объемная доля костной ткани, %	41,34 [34,84 ÷ 55,47]	43,05# [32,70 ÷ 50,60]	54,51*# [44,70 ÷ 60,60]
Толщина костных трабекул, мкм	15,88 [7,84 ÷ 16,47]	15,65 [8,70 ÷ 18,60]	14,05 [11,03 ÷ 20,24]
Численная плотность, 1/мм3	4192 [3500 ÷ 5200]	3900* [2956 ÷ 4325]	4133 [3100 ÷ 5032]
Объемная доля CD-68-пози-тивных клеток, %	456 [355 ÷ 514]	645*# [620 ÷ 671]	1257*# [1162 ÷ 1317]

Примечание. * – достоверные различия с величиной показателя в контрольной группе; # – достоверные различия между показателями в группах ГТ и НТ.

Таблица 2

Экспрессия остеонектина, MMP-9 и TIMP-1 у интактных крыс и при введении экзотоксинов

Показатель	Интактные животные	Сроки эксперимента – 30 суток
		ТМХ	ГМЦ
Индекс синтетической активности остеонектина, %	30,99 [25,53 ÷ 35,75]	25,56*# [23,84 ÷ 26,49]	18,92*# [15,62 ÷ 22,50]
Индекс синтетической активностиMMP-9, %	16,17 [12,53 ÷ 18,09]	27,17* [22,53 ÷ 30,09]	23,12* [21,87 ÷ 25,00]
Индекс синтетической активностиTIMP-1, %	19,61 [16,53 ÷ 23,09]	9,66*# [8,60 ÷ 10,59]	14,41*# [13,12 ÷ 16,25]

Примечание. * – достоверные различия с величиной показателя в контрольной группе; # – достоверные различия между показателями в группах ГТ и НТ.

тельно возрастает остеорезорбция. В итоге постепенно убывает объем минерального и органического матрикса и развивается остеопороз, что снижает эффективность остеоинтеграции при имплантации.

Заключение

Проведенный морфофункциональный анализ костной ткани в условиях интоксикации позволил произвести оценку дегенеративных и регенеративных процессов в кости. Изучение механизмов ремоделирования костной ткани позволит достичь благоприятного течения восстановительных процессов в костной ткани. Для улучшения протекания остеосин-тетических процессов необходимо не только проведение комплексного воздействия на костную ткань, но и системное лечение детоксицирующих органов, так как они чувствитель- ны к воздействию химическими факторами внешней среды. Полученные результаты в дальнейшем можно использовать для изучения остеоинтеграции в условиях имплантации зубных и костных имплантатов.