Морфофункциональные особенности эритроцитов у девушек в зависимости от уровня двигательной активности и наследственного фактора

Введение. Известно, что организм спортсмена подвергается воздействию не только интенсивных физических, но и психоэмоциональных нагрузок, сопровождающихся мобилизацией симпатоадреналовой системы и возрастанием концентрации в крови адреналина [11, 16]. Формирование адреналином местных механизмов регуляции, адаптирующих региональные обменные процессы к целостным реакциям организма, осуществляется через адренорецепторы (АдР), присутствующие на мембранах клеток, в том числе и клеток крови. При этом АдР эритроцитов по строению и структуре не отличаются от АдР других клеток [10, 17], а их функционирование отражает основные принципы адренореактивности разных клеток и дает адекватное представление о системных реакциях организма в ответ на изменение условий его жизнедеятельности [9]. В связи с этим следует ожидать, что на адренореактивность эритроцитов (АРЭ) оказывают влияние физические нагрузки, которые испытывают люди, регулярно занимающиеся спортом.

В то же время многочисленными исследованиями последних лет установлено, что физические возможности организма, способность к выполнению аэробных или скоростносиловых нагрузок генетически детерминированы [4, 13–15]. В частности, к числу генетических маркеров, причастных к развитию физических качеств человека, успешности спортивной деятельности, относят полиморфизм I/D гена АСЕ. Интерес к изучению гена ACE вызван также тем, что фермент, кодируемый им, принимает участие во многих процессах организма: сокращение сосудов, стимуляция синтеза гормонов, регуляция артериального давления и др. [3]. Нами в ряде работ продемонстрировано влияние полиморфизма I/D гена АСЕ на некоторые показатели кислородтранспортной системы организма, в том числе состояние эритроцитарного звена крови у юношей в зависимости от уровня их двигательной активности [2]. Учитывая, что реактивность эритроцитов по отношению к адреналину зависит от функциональных и корпускулярных характеристик эритроцитов [12], мы предположили, что полиморфный вариант rs4646994 гена АСЕ при систематическом выполнении физических нагрузок может оказывать влияние и на агрегационную способность эритроцитов.

Цель исследования. Изучить адренореактивность эритроцитов и ее связи с количественными и качественными характеристиками клеток у девушек с разным уровнем двигательной активности в зависимости от полиморфного варианта I/D гена АСЕ .

Материалы и методы исследования. В исследовании приняли участие девушки-студентки 19–21 лет (n = 51). Из них 1-ю группу составили девушки с относительно малоподвижным образом жизни, не посещающие спортивные секции, с традиционным регламентированным двигательным режимом, предусмотренным в высшем учебном заведении (2 часа физической культуры в неделю) (n = 33). Во 2-ю группу вошли девушки (n = 18), которые помимо физической культуры, проводимой в университете, посещают спортивные секции 3 раза в неделю (лапта и волейбол), их спортивный стаж составлял 3–4 года (спортсменки). Обследование проводилось с соблюдением этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации и Директивах Европейского сообщества (8/609 ЕС). Все испытуемые дали письменное согласие на участие в эксперименте. Протокол эксперимента одобрен комиссией по биоэтике (заключение от 18.10.2017 г.).

Оценку адренореактивности эритроцитов проводили по изменению скорости оседания эритроцитов под действием адреналина in vitro в конечных концентрациях 10^–5; 10^–6; 10^–7; 10^–8; 10^–9; 10^–11; 10^–13 г/мл венозной крови [8]. В соответствии с направленностью сдвигов СОЭ в присутствии адреналина мы выделили 3 типа АРЭ, обозначенные как: 1) антиагрегационный (АнАг) – если средние отклонения

СОЭ от исходного уровня имели положительный знак, то есть после внесения адреналина значения СОЭ были ниже, чем в исходной пробе (позитивный эффект); 2) агрегационный (Аг) – при котором средние отклонения СОЭ от уровня исходной пробы при различной концентрации адреналина имели отрицательный знак, то есть после внесения адреналина значения СОЭ были выше, чем в контроле (негативный эффект); 3) ареактивный (Ар) – при отсутствии заметного отклонения СОЭ при внесении адреналина в различной концентрации. Известно, что действие адреналина на клетки определяется его концентрацией [1, 7]. Физиологическая концентрация адреналина в крови составляет 10^–9 г/мл и ниже, при стрессовых ситуациях содержание адреналина превышает 10^–8 г/мл. Учитывая этот факт, мы оценивали эффекты адреналина отдельно для его физиологических (10^–9; 10^–11; 10^–13 г/мл) и стрессовых (10^–5; 10^–6; 10^–7; 10^–8 г/мл) концентраций . Помимо регистрации направленности сдвигов в эксперименте определялись и количественные показатели АРЭ: средние значения при воздействии на кровь физиологических (АРЭ ср. ФКА) и стрессовых доз адреналина (АРЭ ср. СКА), а также максимальное (АРЭ макс.) отклонение СОЭ от исходного уровня при воздействии на кровь испытанных доз адреналина.

Суммарные и индивидуальные характеристики эритроцитов (количество – RBC, Hb, средний объем – MCV, среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците – MCH, среднюю концентрацию гемоглобина в клетке – MCHC, гематокрит – Ht) определяли с помощью гематологического анализатора ADVIA 60 производства BAYER (Германия).

Для генетического анализа использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов крови методом фенольно-хлороформной экстракции [18]. Метод определения полиморфного варианта rs4646994 гена ACE заключался в амплификации специфических фрагментов ДНК (полимеразная цепная реакция) с помощью специфических олигонуклеотидов (прямой праймер – 5'-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3', обратный праймер – 5'-GATGTGGCCATCA CATTCGTCAGAT-3' («Cинтол», Россия)). ПЦР проводилась на термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК технология», Москва). Результаты амплификации оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 7 % полиакриламидном геле (ПААГ).

Статистический анализ данных производили с помощью пакета программ Microsoft Office Excel и Statistics Version 10.0. Встречаемость разных типов АРЭ у девушек при разных генотипах гена АСЕ определяли с помощью критерия χ² (с поправкой Йетса на непрерывность). Для оценки достоверности показателей использовали непараметрические критерии: при сравнении двух независимых выборок использовали U-критерий Манна – Уитни. Количественные данные представлены в виде медианы значений ( Ме ) и интерквартильного размаха с описанием значений 25 и 75 перцентилей: Ме (25 %; 75 %). Для выявления скрытых переменных, объясняющих взаимоотношения изученных параметров, использовали факторный анализ. При проведении корреляционного анализа использовали критерий Спирмена. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

Результаты исследования. В группе девушек с высоким уровнем двигательной активности при генотипах D/D и I/D гена АСЕ частотный анализ продемонстрировал статистически значимое различие встречаемости агрегационного типа АРЭ. Установлено, что у спортсменок с I/D генотипом как при воздействии на пробы крови ФКА, так и СКА преобладает агрегационное поведение эритроцитов, а носительницам D/D генотипа Аг тип АРЭ не свойствен (χ2 = 5,60, р = 0,008, OR = = 0,04 [0,001–0,9]). При этом у девушек с генотипом D/D с одинаковой частотой встречается Ар и АнАг типы АРЭ (р > 0,05). В связи с малочисленностью групп девушек с генотипом I/I и с высоким, и с низким уровнем ДА частотный анализ проводился только для двух генотипов (см. рисунок).

При сравнительном анализе изученных показателей у девушек обеих групп с вариантами I/D полиморфизма гена АСЕ не выявились статистически значимые различия базовых параметров красной крови, в то же время обнаружились генотипические особенности параметров, характеризующих адренореактивность эритроцитов (табл. 1).

Так, судя по знаку АРЭ при генотипе D/D у девушек-спортсменок в ответ на воздействие как ФКА, так и СКА агрегационная активность эритроцитов снижается, тогда как при гетерозиготном генотипе при внесении адреналина в кровь in vitro происходит повышение СОЭ (негативный эффект). Количественная оценка величин АРЭ позволила установить у спортсменок с генотипом D/D достоверно более высокие значения АРЭ при использовании ФКА, чем при генотипе I/D (р < 0,05). Максимальное отклонение АРЭ было выше также при D/D варианте гена (p < 0,05).

В группе девушек с малоподвижным образом жизни генотипические различия выражены слабее и при всех генотипах выявляются отрицательные значения АРЭ. При этом у обладателей I/D варианта гена значения АРЭ при использовании как ФКА, так и СКА оказались значимо ниже по сравнению с девушками с генотипом D/D и имеющих высокую ДА (р < 0,05).

Обнаруженная в эксперименте разнона-

Встречаемость разных типов АРЭ у девушек с высоким уровнем двигательной активности в зависимости от полиморфизма rs4646994 гена АСЕ Frequency of different types of ARE in young women with a high level of motor activity depending on the rs4646994 polymorphism of the ACE gene

Таблица 1

Table 1

Сравнительный анализ показателей крови и АРЭ у девушек с низкой и высокой двигательной активностью, Me (25 %, 75 %) Comparative analysis of blood indices and adrenergic reactivity of erythrocytes (ARE)

in young women with low and high values of motor activity, Me (25 %; 75 %)

Показатель Indicator	Группа 1 / Group 1			Группа 2 / Group 2
	D/D (n = 10)	I/D (n = 19)	I/I (n = 4)	D/D (n = 6)	I/D (n = 9)	I/I (n = 3)
Гемоглобин, г/л HGB, g/l	122,4 (119; 130)	125 (119; 132)	120 (116; 125)	122,3 (123; 128)	122,2 (121; 126)	124 (114; 134)
Эритроциты, 1012/л RBC, 1012/l	4,37 (4,1; 4,6)	4,49 (4,3; 4,6)	4,1 (3,9; 4,2)	4,39 (4,1; 4,5)	4,4 (4,1; 4,7)	4,4 (4,1; 4,7)
Гематокрит, % HCT, %	38,3 (36,7; 39,5)	38,6 (36,7; 40,4)	35,2 (34,4; 35,9)	38,52 (36,9; 40,4)	37,6 (35,2; 38,5)	36,6 (33,3; 38,6)
Средний объем эритроцитов, фл. MCV, fl	87,7 (85,4; 90,6)	85,9 (81,9; 90,8)	85,8 (82,2; 89,4)	87,48 (83,5; 90,6)	85,7 (84,1; 92,2)	81,2 (79,9; 83,0)
Cреднее содержание гемоглобина в эритроците, пг MCH, pg	27,9 (27,7; 29,2)	27,7 (27,0; 29,1)	29,8 (29,2; 30,4)	27,75 (27,5; 29,4)	27,9 (28,0; 30,0)	27,4 (27,0; 28,1)
Cредняя концентрация гемоглобина в клетке, г/л MCHC, g/l	318 (311; 326)	323 (318; 326)	343 (332; 354)	317 (312; 330)	318 (313; 328)	338 (325; 347)
АРЭ ср. ФКА, мм/ч ARE average PCA, mm/h	–0,42 (–1,6; 3,0)	-2,39 ▲ (-4,0; 0)	–1,5 (–2,0; –1,0)	4,45* ▲ (-0,3; 3,0)	-2,13* (-3,0; -1,0)	0,56 (–1,3; 3,0)
АРЭср.СКА, мм/ч ARE average SCA, mm/h	–1,8 (–5,0; 1,0)	-2,57 ▲ (-4,0; 0)	–1,75 (–2,5; –1,0)	4,17^ (-1,0; 2,5)	–2,67 (–6,5; –1,0)	0,33 (–2,0; 3,0)
АРЭ макс.ФКА, мм/ч ARE max. PCA, mm/h	–0,3 (–3,0; 3,0)	-2,73 ▲ (-5,0; 0)	–2,0 (–2,5; –1,5)	4,3 ▲ (-10; 3,0)	–2,44 (–4,0; –1,0)	0,33 (–2,0; 3,0)
АРЭ макс.СКА, мм/ч ARE max. SCA, mm/h	–1,7 (–5,0; 1,0)	-2,78 ▲ (-5,0; 0)	–2,0 (–2,5; –1,5)	4,67* ▲ (0,0; 3,0)	-2,78* (-7,0; -1,0)	0,33 (–2,0; 3,0)

Примечание. * – наличие статистической достоверности между девушками с высоким уровнем ДА и генотипом D/D и I/D; ▲ – наличие статистической достоверности между девушками с ВДА и студентками с НДА, носительницами генотипа D/D, р < 0,05.

Note. * – statistically significant difference between young women with a high level of MA and the D/D and I/D genotypes; ▲ – statistically significant difference between young women with HMA and female students with LMA, carriers of the D/D genotype.

правленность колебаний величин АРЭ в зависимости от наследственного фактора и уровня физической активности, обусловлена, очевидно, различиями функционального состояния циркулирующих эритроцитов и возрастным составом их популяции. Известно, что молодым и зрелым эритроцитам свойственна адекватная реакция на адреналин, выражающаяся в возрастании внутриклеточного энергообмена и увеличении величины поверхностного заряда [5]. По мере физиологического старения эритроцитов вследствие модификации мембран и истощения энергетических ресурсов снижается поверхностный заряд клеток и возрастает их склонность к агрегации [6].

Можно допустить, что систематические физические нагрузки благодаря влиянию на состав периферического звена эритрона способствуют оптимизации энергетических резервов клеток и их мобилизации адреналином. Вместе с тем из результатов исследования вытекает, что данный эффект проявляется отчетливо лишь у носителей D/D генотипа гена АСЕ. Этот факт, возможно, обусловлен повышенным тонусом гладкой мускулатуры сосудов у его носителей.

Результаты корреляционного анализа подтвердили наличие ассоциации полиморфизма гена АСЕ с адренореактивностью эритроцитов в группе девушек с высокой ДА. Показана прямая корреляционная связь полиморфного варианта I/D гена АСЕ со средними значениями АРЭ при воздействии ФКА, а также с максимальным отклонением СОЭ при воздействии СКА. Помимо изменений количественных показателей АРЭ выявлена взаимосвязь полиморфного варианта гена АСЕ с направленностью сдвигов СОЭ (табл. 2).

Для оценки взаимосвязей адренореактив- ности эритроцитов с их количественными, качественными и корпускулярными характеристиками был использован факторный анализ. Данные факторного анализа по учтенным показателям в группах обследованных девушек с разными генотипами I/D полиморфизма гена АСЕ представлены в табл. 3.

Таблица 2

Table 2

Коэффициенты ранговой корреляции Спирмена ( r )

между морфофункциональными характеристиками крови и полиморфизмом гена АСЕ Spearman's rank correlation coefficients (r) between morphofunctional characteristics of blood and the ACE gene polymorphism

Показатель Indicator	Группа 1 / Group 1		Группа 2 / Group 2
	r	p	r	p
АРЭ ср. ФКА, мм/ч ARE average PCA, mm/h	0,28	0,14	0,52*	0,04
АРЭ ср. СКА, мм/ч ARE average SCA, mm/h	0,17	0,37	0,47	0,07
АРЭ макс. ФКА, мм/ч ARE max . PCA, mm/h	0,34	0,07	0,50	0,05
АРЭ макс. СКА, мм/ч ARE max. SCA, mm/h	0,20	0,29	0,52*	0,04
Типы АРЭ ФКА ARE type PCA	0,36	0,05	0,55*	0,03
Типы АРЭ СКА ARE type SCA	0,20	0,29	0,55*	0,03

Примечание. * – значимые корреляционные зависимости (р < 0,05).

Note. * – statistically significant correlations (p < 0.05).

Таблица 3

Table 3

Факторная структура показателей крови и АРЭ у девушек с разным уровнем двигательной активности Factor structure of blood indices and adrenergic reactivity of erythrocytes in young women with different levels of motor activity

Показатель Indicator	ВДА High physical activity		НДА Low physical activity
	Фактор 1 Factor 1	Фактор 2 Factor 2	Фактор 1 Factor 1	Фактор 2 Factor 2
АСЕ	–0,18	0,76	–0,51	–0,05
Гемоглобин, г/л / HGB, g/l	–0,87	–0,21	0,67	–0,62
Эритроциты, 1012/л / RBC, 1012/l	0,25	0,45	0,45	–0,07
Гематокрит, % / HCT, %	–0,83	0,09	0,37	–0,73
Средний объем эритроцита, фл. MCV, fl	–0,89	–0,27	–0,09	–0,85
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг MCH, pg	–0,87	–0,47	0,45	–0,77
Средняя концентрация гемоглобина в клетке, г/л MCHC, g/l	–0,46	–0,54	0,74	–0,17
АРЭ ср. ФКА, мм/ч / AREaverage PCA, mm/h	–0,79	0,48	–0,75	–0,49
АРЭ макс., мм/ч / AREmax. SCA, mm/h	–0,80	0,48	–0,80	–0,37
Типы АРЭ ФКА / ARE type PCA	–0,35	0,92	–0,87	–0,31
Типы АРЭ СКА / ARE type SCA	–0,35	0,92	–0,73	–0,41
Дисперсия, % / Dispersion, %	50	27	31	28

Примечание. Представлены только достоверные корреляции к фактору. Note. Only reliable correlations are shown.

У девушек с высоким уровнем физической активности в факторной структуре доминирует фактор (50 % дисперсии), описывающий взаимоотношения морфофункциональных характеристик эритроцитов с их реактивностью по отношению к действию in vitro адреналина. Учитывая знаки корреляций переменных с фактором, можно заключить, что ослабление функциональной активности красной крови (снижение уровня Hgb, Hct, MCV, MCH) взаимосвязано с понижением энергетических резервов эритроцитов, проявляющимся в уменьшении средних и максимальных значений АРЭ при воздействии на кровь ФКА. Структура этого фактора подтверждает высказанное выше предположение о роли функционального состояния красной крови в обеспечении стабильных реологических свойств эритроцитов.

F2 в группе девушек-спортсменок – фактор генетической детерминированности – объединяет полиморфизм гена АСЕ и типы АРЭ. При этом лицам с генотипом D/D гена АСЕ свойственно преобладание Ар и АнАг типов АРЭ.

У физически малоактивных девушек указанные факторы не обнаруживаются: в отличие от первой группы здесь F1 – фактор адренореактивности, с которым помимо параметров АРЭ коррелирует только MCHC. F2 – фактор, который, объединяя качественные показатели крови, такие как MCV, MCH, Hct, с одноименными знаками, не включает АРЭ и генетический маркер (см. табл. 3).

Заключение. Изучение у девушек как реально фиксируемых морфофункциональных показателей эритроцитов, так и системы их корреляций позволило установить, что генотипические различия по полиморфизму I/D гена АСЕ проявляются главным образом у лиц, обладающих повышенной физической активностью. Ранее более выраженное влияние полиморфизма I/D гена АСЕ на параметры красной крови при высокой двигательной активности было продемонстрировано нами на примере юношей-спортсменов [2]. Положительный вклад систематических физических нагрузок заключается в том, что у девушек-носителей генотипа D/D гена АСЕ , занимающихся спортом, наблюдается более высокая устойчивость эритроцитов к воздействию не только физиологических, но и стрессовых доз адреналина.

Определение АРЭ по СОЭ-зависимой реакции может служить прогностическим критерием при определении устойчивости организма спортсмена к стрессовым факторам. При этом, как показало данное исследование, на агрегационные способности эритроцитов оказывает влияние не только уровень двигательной активности, но и полиморфный вариант rs4646994 гена ACE.