Морфофункциональные параметры тромбоцитов у собак разного возраста при парвовирусной инфекции

Актуальность

Парвовирусная инфекция плотоядных вызывается ДНК-содержащим вирусом, широко распространена и вызывает тяжелое, угрожающее жизни состояние [1, 2]. Основным патогенететическим проявлением парвирусной инфекции собак является вирус-индуцированная деструкция быстро делящихся клеток, включая клетки эпителия крипт кишечника, тимуса, лимфоузлов и клеток-предшественников костного мозга. Возникающая септицемия и эндотоксемия вызывает системный воспалительный процесс и гиперкоагуляцию, что приводит пациента к мультиорганной дисфункции и смерти [3, 4, 5].

Медицинские исследования показывают, что в период вирусемии выделяются биологически активные вещества, которые способствуют повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла и приводят к расширению микрососудов. Среди патологических изменений в системе микроциркуляции особого внимания заслуживают внутрисосудистые расстройства, так как именно они приводят к ухудшению кровоснабжения жизненно важных органов, развитию ишемических и некротических процессов. Если в физиологических условиях тромбоциты могут играть защитную роль в отношении эндотелия, то во время вирусных инфекций они способствуют еще большему повреждению сосудистой стенки. В экспериментах на животных показано, что тромбоцитарные агрегаты, появляясь в микроцир-куляторном русле, способны повреждать нормальную сосудистую стенку, вызывая тем самым развитие васкулита [6]. Повреждение вирусами и их токсинами эндотелия и других слоев сосудистой стенки, клеток крови при парвовирусном энтерите ведет к активации свертывающей системы и ухудшению тканевого кровотока, что способствует развитию осложнений и увеличивает вероятность неблагоприятного исхода [7].

C.М. Otto и соавторы (2000) в исследовании на 9 собаках установили, что при парвовирусном энтерите имеются такие признаки гиперкоагуляции, как увеличение концентрации фибриногена, удлинение АЧТВ, уменьшение активности антитромбина и увеличение максимальной амплитуды тромбоэластограммы, при этом не отмечено повышения уровня д-димеров и изменений в количестве тромбоцитов. У четырех из 9 собак были клинические признаки венозного тромбоза или флебита, связанные с катетерами. У одной собаки был мультифокальный тромбоз селезенки, выявленный при вскрытии [8]. При этом A. Goddard и соавторы (2010) не встречали тромбоза венозных катетеров у собак с парвовирусной инфекцией [9].

Такие патоморфологические признаки, как обширные участки некроза в кишечнике, серозно-геморрагический лимфаденит с мелкоточечными кровоизлияниями, геморрагические инфаркты в селезенке у 3 щенков, серозно-геморрагический перикардит с участком некроза миокарда около 2 см в диаметре у 1 щенка, отек легких с крупноточечными кровоизлияниями под плеврой у 12 щенков, выявленные В.И. Балабановой при вскрытии 25 щенков, погибших от парвовирусной инфекции, ярко иллюстрируют наличие гемореологических нарушений [10].

Возраст собак имеет большое значение при патогенезе парвовирусной инфекции, так как вирус размножается в активно делящихся клетках миокарда и в кишечном эпителии. Наиболее часто заболевают собаки в возрасте от 2 до 6 месяцев [11], при этом у здоровых щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев более выражены адгезивно-агрегационные свойства сосудистого эндотелия, чем у взрослых животных [12].

Поэтому целью нашего исследования стало выявление морфофункциональных параметров тромбоцитов у собак разного возраста при парвовирусной инфекции.

Материалы и методы

Исследования, положенные в основу диссертации, выполнены в 2013–2018 гг. на собаках разного возраста, принадлежащих частным владельцам города Вологды, Вологодскому кинологическому центру УВД, а также Вологодскому обществу защиты животных «Велес». Лабораторные исследования проведены на базе кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства Вологодской ГМХА и частных ветеринарных клиник «Надежда» и «Возрождение» города Вологды.

Исследование проводили в два этапа.

На первом этапе исследований определили показатели гемостаза у 30 клинически здоровых собак в трех возрастных контрольных группах. В первую группу включили щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев (n=10 собак); во вторую группу – молодых собак в возрасте от 6 месяцев до 1 года (n=10 собак); в третью группу – взрослых собак в возрасте от 1 до 8 лет (n=10 собак).

На втором этапе изучили изменения в крови у 25 собак, больных парвовирус-ной инфекцией. Диагноз ставили с помощью клинического осмотра и выявления антигена парвовируса в фекалиях собак хроматографическим иммунохимическим методом с использованием одношагового экспресс-теста VetExpert CPV Ag. Больных животных, согласно возрасту, разделили на 3 опытные группы: щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев (опыт 1, n=15 собак), молодых собак в возрасте от 6 месяцев до 1 года (n=6 собак), взрослых собак в возрасте от 1 года до 8 лет (n=4 собаки).

Собакам этих опытных групп применялась стандартизированная терапия, включающая введение раствора Рингера-Локка 30‒60 мл/кг в сутки с целью регидратации, дезинтоксикации и восполнения электролитов, ампициллин 20‒40 мг/ кг/каждые 8 часов внутривенно для профилактики бактериальной инфекции. Рвоту купировали с помощью подкожного введения маропитанта цитрата (Серения) в дозе 1 мг/10 кг каждые 24 часа первые 3‒5 дней болезни. После купирования рвоты применяли Энтеросгель по 2‒5 г 6 раз в сутки перорально и диетический рацион Роял Канин Рекавери (примерно по 1 ст. ложке 6 раз в сутки). В качестве специфической терапии применяли сыворотку Гискан-5 в дозе 1‒2 мл на животное подкожно трехкратно с интервалом 24 часа. Все четыре погибшие собаки были в возрасте от 2 до 6 месяцев.

У животных опытных групп определяли морфологические и гемостатические показатели на 3 и 5 день болезни с момента появления клинических признаков. Для морфологического исследования крови использовали вакуумные пластиковые пробирки с ЭДТА. Определение уровня тромбокрита (PCT) и среднего объема тромбоцита (MPV) производили с помощью автоматического гематологического анализатора Exigo 17 (Boule Medical A.B., Швеция). Однако при подсчете тромбоцитов с наличием атипичных форм и тромбоцитарных агрегатов автоматические счетчики могут давать искаженную информацию [13, 14], поэтому каждый результат перепроверяли вручную. Количество тромбоцитов подсчитывали в мазке крови, окрашенной по Романовскому – Гимзе.

Кровь для гемостазиологического исследования брали в вакуумные пластиковые пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия. С помощью центрифугирования получали обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) и бедную тромбоцитами плазму (БТП).

Адгезивно-агрегационную активность тромбоцитов определяли количествен- ным методом с применением фотоэлектроколориметра (ФЭК) КФК-2 по Howard M. A. [15]. Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) с индукторами агрегации – АДФ (концентрация 0,1 мг/мл), коллагеном (концентрация 20 мг/мл) и ристомицином (концентрация 15 мг/мл).

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программного пакета Statistica 6.1. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M ± m).

Результаты исследования со значением вероятности допущения альфа-ошибки, равные либо менее 5% (р ≤ 0,05), расценивались как статистически значимые. Сравнение независимых выборок проводили с помощью критерия Манна – Уитни, зависимых ‒ с помощью критерия Вилкоксона.

Результаты исследования

Наибольшее количество собак, заболевших парвовирусной инфекцией, по данным большинства авторов, приходится на возраст от 2 до 6 месяцев.

У щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев, больных парвовирусной инфекцией, количество тромбоцитов относительно контрольной группы (405,77 ± 13,11 ×109/л) понижается и составляет 349,62±25,69×109/л на 3-й день (р=0,039) и 306,2±40,38×109/л на 5-й день (р=0,019).

Тромбокрит на третий день болезни незначительно повысился и составил 0,47±0,06% (контроль 0,35±0,03%), а средний объем тромбоцита изменений не претерпел и равнялся 6,9±1,2 фемтолитров (контроль 7,5±0,9 fl).

На пятый день болезни в морфологических параметрах тромбоцитов произошли изменения: тромбокрит достоверно уменьшился и составил 0,28±0,06% (р = 0,005), средний объем тромбоцита слегка вырос до 8,3±1,5 фемтолитров, что отличается от результатов контрольной группы (р = 0,0025).

Выявлено, что у здоровых щенков контрольной группы более выражены адгезивно-агрегационные свойства сосудистого эндотелия (СИАТ под действием ри-стомицина составил 110,69±12,36 %, в группе взрослых собак ‒ 78,28±10,12 %), тогда как функциональная активность тромбоцитов у больных щенков меняется незначительно (табл. 1) и проявляется понижением индексов дезагрегации тромбоцитов с коллагеном (4,2±1,78%, контроль 7,15 ± 1,52 %, р = 0,067) на 5-й день болезни и ристомицином на 3-й день болезни (2,18±0,95%, контроль, р =0,009) и на 5-й день болезни (0,9±0,5%, р=0,007). В опытах с плазмой здоровых и больных ангиогемофилией людей было установлено, что антибиотик ристомицин (ристо-цетин) стимулирует in vitro взаимодействие фактора фон Виллебранда с тромбоцитарным гликопротеином Ib. Установлена линейная зависимость между степенью ристоцетиновой агрегации и количеством фактора фон Виллебранда, который отвечает за прикрепление тромбоцитов к сосудистой стенке [16].

Таблица 1. Тромбоцитарный гемостаз у щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев, больных парвовирусной инфекцией, M ± m

Показатель, Ед. измерения	Контрольная группа, n = 10	Опытная группа, n = 15
		3 день	5 день
Агрегация с АДФ
СИАТ, %	92,96 ± 10,23	108,32±13,90	110,92±52,91
СА, мин	0,01 ± 0,0026	0,0097±0,004	0,0151±0,0037
ИДТ, %	5,31 ± 1,19	4,82±2,1	7,06±3,22
Агрегация с коллагеном

Показатель, Ед. измерения	Контрольная группа, n = 10	Опытная группа, n = 15
		3 день	5 день
СИАТ, %	114,01 ± 12,05	126,64±15,64	105,32±43,62
СА, мин	0,01 ± 0,0036	0,015±0,005	0,0139±0,0066
ИДТ, %	7,15 ± 1,52	5,85±1,67	4,2±1,78
Агрегация с ристомицином
СИАТ, %	110,69 ± 12,36	110,66±14,01	123,52±57,21
СА, мин	0,01 ± 0,0028	0,0094±0,003	0,0094±0,003
ИДТ, %	5,75 ± 1,26	2,18±0,95	0,9±0,5

Количество тромбоцитов в группе молодых собак в связи с парвовирусной инфекцией не менялось и составило 338,2±26,1×109/л на 3-й день и 338,6±31,3 ×109/л на 5-й день болезни. Тромбокрит составил 0,36±0,06%, а средний объем тромбоцита – 8,1±0,9 фемтолитров, что не отличалось от результатов контрольной группы.

Функциональная активность тромбоцитов молодых собак с парвовирусной инфекцией также не претерпела существенных изменений и выражалась только в уменьшении ИДТ с АДФ (р=0,043) на 5-й день болезни (табл. 2) .

Таблица 2. Тромбоцитарный гемостаз у молодых собак в возрасте от 6 месяцев до 1 года, больных парвови-русной инфекцией, M ± m

Показатель,	Контрольная группа,	Опытная группа, n = 6
Ед. измерения	n = 10	3 день	5 день
Агрегация с АДФ
СИАТ, %	79,21 ± 9,74	73,32±13,04	85,1±15,42
СА, мин	0,01 ± 0,002	0,0148±0,0044	0,0072±0,0023
ИДТ, %	4,49 ± 1,41	6,83±1,88	2,15±1,63
Агрегация с коллагеном
СИАТ, %	93,86 ± 9,54	89,32±10,68	100,8±12,53
СА, мин	0,02 ± 0,003	0,0121±0,0044	0,0212±0,006
ИДТ, %	3,06 ± 1,02	1,43±0,87	4,7±1,62
Агрегация с ристомицином
СИАТ, %	62,61 ± 8,21	78,8±6,79	75,04±12,5
СА, мин	0,02 ± 0,008	0,0114±0,0037	0,0298±0,015
ИДТ, %	4,63 ± 1,55	4,24±1,01	5,02±3,04

Все собаки, составляющие группу взрослых собак, являлись безнадзорными и содержались в приюте, где заболели парвовирусной инфекцией (возможно вследствие понижения иммунитета на фоне стресса от отлова и скученного содержания).

Клинически болезнь протекала легче, чем у более молодых собак, и закончилась выздоровлением у всех собак в возрасте от 1 до 8 лет.

Количество тромбоцитов не выходило за пределы нормативных значений и составило 347,63±22,07×109/л на 3-й день и 372,53±30,33×109/л на 5-й день болезни (контроль 361,07 ± 23,35×109/л).

На третий день болезни тромбокрит составил 0,35±0,04 % (контроль 0,31±0,02 %), а средний объем тромбоцита 7,9±0,3 фемтолитров (контроль 8,6±0,3 fl), на пятый день в морфологии тромбоцитов также не произошло существенных изменений – тромбокрит равнялся 0,29±0,05 %, а средний объем тромбоцита 8,5±0,6 фемтолитров.

Тромбоцитарные функции (табл. 3) существенно не изменились за исключением ИДТ с АДФ, который значительно снизился с 8,06±1,99% на 3-й день до 1,32±0,85%, на 5-й день болезни (р=0,043, контроль 4,59 ± 0,89%).

Таблица 3. Тромбоцитарный гемостаз у собак в возрасте от 1 до 8 лет, больных парвовирусной инфекцией, M ± m

Показатель, Ед. измерения	Контрольная группа, n = 10	Опытная группа, n = 4
		3 день	5 день
Агрегация с АДФ
СИАТ, %	81,43 ± 6,81	84,73±13,04	90,63±13,86
СА, мин	0,018 ± 0,003	0,0368±0,0126	0,0113±0,0049
ИД Т, %	4,59 ± 0,89	8,06±1,99	1,32±0,85
Агрегация с коллагеном
СИАТ, %	85,32 ± 7,45	95,63±14,52	103,33±11,05
СА, мин	0,014 ± 0,002	0,0158±0,0061	0,0145±0,005
ИДТ, %	5,02 ± 0,94	5,72±1,31	2,94±1,14
Агрегация с ристомицином
СИАТ, %	78,28 ± 10,12	84,75±9,96	118,75±15,59
СА, мин	0,016 ± 0,003	0,0219±0,008	0,0231±0,013
ИДТ, %	5,18 ± 0,99	5,87±2,28	2,56±1,68

Заключение

Парвовирусная инфекция собак у щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев клинически проявляется наиболее тяжело, при этом на третий день болезни уменьшается количество тромбоцитов и индекс дезагрегации тромбоцитов под действием ристо-мицина, что говорит о высокой активности сосудистого компонента и образовании более прочных агрегатов. На пятый день болезни происходит прогрессирующее уменьшение количества тромбоцитов вместе с понижением тромбокрита и повышением объема тромбоцита, уменьшается дезагрегация тромбоцитов под действием коллагена и ристомицина, что является признаком повышения функциональной активности тромбоцитов, а в частности, ее сосудистого компонента.

Количество тромбоцитов при парвовирусной инфекции в старших возрастных группах (молодых и взрослых собак) остается без изменений. Возможно, это связано с тем, что клетки-предшественники тромбоцитов в костном мозге у собак в возрасте младше 6 месяцев более уязвимы для парвовируса.

Изменения функциональной способности тромбоцитов в группах молодых и взрослых собак при парвовирусной инфекции появляются лишь на 5 день болезни и выражаются уменьшением дезагрегации по действием АДФ. Это свидетельствует об образовании более стойких агрегатов под действием АДФ, которая в норме содержится в плотных гранулах тромбоцитов.

В целом можно заключить, что при парвовирусной инфекции наиболее сильно изменяются тромбоцитарные параметры у щенков в возрасте от 2 до 6 месяцев, возможно вследствие незрелости кроветворной системы и поражения вирусом интенсивно делящихся клеток костного мозга.