Морфогенез кожного регенерата и локальные факторы его регуляции

Введение. Известные способы ускорения заживления ран, ожогов, травм направлены на стимуляцию биологических потенций клеток, участвующих в репарации. Состояние раневого дефекта на различных стадиях восстановления нарушенной структуры зависит от активности регуляторных факторов локального и дистантного характера действия, способа обработки и клинического ведения раневого дефекта [1-5].

Расшифровка процессов репарации зачастую проводится с позиции эстафетности этапов воспаления и связанных с ними миграционных перемещений клеток, производных эпителиальных, нейральных, мезенхимальных дифферонов, мезенхимально-эпителиаль- ных либо эпителиально-мезенхимальных переходов.

На сегодняшний день регенеративной медициной накоплен значительный опыт применения различных раневых повязок, имеется большой объем информации о технических характеристиках используемых для этих повязок материалов, различных эффектах заживления в зависимости от действующего начала лечебного компонента [6–11].

В настоящее время в экспериментах по изучению активности регенераторных процессов уделяется внимание состоянию симбиотических отношений про- и эукариотов и использованию ген-компонентов, обладающих индуктивным влиянием на клеточные компартменты регенерата [12, 13]. Недостаточно изученным остается феномен эстафетной трансформации провизорного морфологического субстрата в дефинитивное состояние [14]. Перспектива внедрения математического моделирования морфогенеза несомненна [15–18].

Структура регенерата может зависеть от присутствия в его составе клеток-промоторов, выполняющих роль индукторов и контролеров трансформации клеточных коопераций в эпителиальном и мезенхимальном компонентах [19].

Цель исследования. Выявить значение клеток-промоторов, температурного фактора и геля «Эйковит» на этапах заживления раневого дефекта кожи, термического ожога и контактного дерматита. Обозначить этап трансформации провизорного регенерата в дефинитивное состояние.

Материалы и методы. Репаративную регенерацию кожи изучали на моделях травматического повреждения кожи спины аутбред-ных мышей-самцов массой 25±5 г. Экспериментальные животные (126 особей) были распределены на 4 группы: «Полнослойная кожная рана», «Термическое повреждение», «Контактный дерматит», «Контроль».

Термический ожог формировали аппаратом «Терцик» RS232S (Россия) с выносным металлическим модулем площадью 1 см2. Экспозиция составляла 3 мин при температуре 80 оС, что соответствовало ожогу II степени.

Контактный дерматит моделировали втиранием в кожу мышей 0,5 % спиртово-аце-тонового раствора 2,4-динитрохлорбензола (2,4-ДНХБ, «Ленреактив», Россия) по 5 мин 1 раз в сутки в течение 5 дней. При термическом повреждении и контактном дерматите использовали два варианта: с внешним стимулом в виде геля «Эйковит» и без него. Гель «Эйковит» – это продукт из жира сиговых рыб Салехардского рыбоконсервного комбината, содержит комплекс полиненасыщенных жирных кислот (ТУ 9158-001-3445816695).

Кожную рану формировали в соответствии с моделью плоскостной асептической кожной раны по Турищеву. Под эфирным наркозом в стерильных условиях вырезали лоскут кожи по пластиковому трафарету овальной формы с отверстием 3×4 мм. С помощью пинцета вытягивали кожу через трафарет на 2 мм кнаружи и отрезали ножницами. Подкожная мышца при этом не затрагивается, получается полнослойный лоскут и открытая рана площадью 60–70 мм2.

Контракцию краев и динамику заживления выявляли измерением площади раневого дефекта. Скорость контракции определяли по формуле V=(Sn-S/Sn)×100 %, где Sn – площадь при предыдущем измерении, S – площадь при последующем измерении.

Использовали два режима теплового воздействия: «холод» (температура +8 оС) и «тепло» (+42 оС). Температурный режим в «Контроле» соответствовал нормальной температуре тела экспериментального животного (+33 оС). Время воздействия температурного фактора – 30 с, режим воздействия – 1 раз в сутки начиная с первого дня заживления кожной раны и до 30-х сут.

Регенераты забирали в пределах здоровых тканей после декапитации животного под глубоким эфирным наркозом на 3, 7, 10, 14, 20, 30-е сут эксперимента, фиксировали в 10 % нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином [20]. Животных содержали в стандартных условиях вивария с учетом действующего законодательства РФ и положений Хельсинкской декларации об этических принципах медицинских исследований, утверж- денной Всемирной медицинской ассоциацией в 1964 г. Имеется разрешение ЛЭК Тюменского ГМУ на проведение экспериментов (протокол № 14 от 07.06.2018).

Иммуногистохимическим методом выявляли антигены Ki-67, CD1-альфа, CD3, CD31. Реактивы применяли согласно рекомендациям фирмы-производителя (Thermo Fisher Scientific, MA, США). Результаты оценивали методом полуколичественного анализа визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток. Ki-67-позитив-ную реакцию использовали для выявления индекса пролиферации: I=(n+/N)×100 %, где n+ – число окрашенных ядер, N – общее число ядер в исследуемом массиве в 20–30 полях зрения микроскопа при об. 100, ок. 10 в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, формирующихся сальных железах, волосяных фолликулах и сосочковом слое дермы.

Гистопрепараты изучали с помощью медицинского микровизора mVizo-101 («ЛОМО», Россия), микроскопа MEIJI-4200 (MEIJI Techno, Япония) и цифровой камеры Canon EOS 5D (Япония). Изображения переносили на персональный компьютер, проводили морфометрический анализ, используя пакет UTHSCHA Image Tools для среды Windows. Статистический анализ осуществляли с помощью IBM StatSoft Statistics (США). В нормально распределенных выборках использовали Т-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Анализ фактического материала проведен с позиций органотипической детерминированности тканей [21], принципа провизорности и морфогенетических корреляций в регенерирующем участке пораженного органа. Классическое представление о воспалительных разрастаниях эпителиев [22] было дополнено привлечением понятий о дивергенции, хроновекторе конвергенции клеток, производных дифферонов различного генеза на этапах регенерации, выявлении критических стадий становления эпидермального и мезенхимального компонентов регенерата, значимости клеток-промоторов морфогенеза и адаптивной реакции регене- рата на действие факторов экосреды слабой интенсивности.

Разрастания эпителия были представлены выстилающим и погружным вариантами, инфильтративного роста не наблюдалось.

Первые трое суток опыта сопровождались формированием эпителиальных наплывающих пластов из краевых дефектов и в сохранившихся островках кожи между пораженным и интактным участками. В парабазаль-ных слоях сохранившегося эпидермиса выявлялись нарушения воспалительного характера в виде вакуолизации, спонгиоза, акантоза, отмечалась гиперемия сосочкового слоя дермы. К концу третьих суток определялся пограничный лейкоцитарный вал между гиподермой и сетчатым слоем дермы.

При термическом ожоге и контактном дерматите оформлялся надэпидермальный детрит, состоявший из отслоившихся ороговевших слоев эпидермиса, участков корней и стержней волос, сгустков фибрина и компонентов сальных желёз – происходило оформление струпа (рис. 1).

Воспалительная реакция дермального слоя сопровождалась альтеративными и регенеративными проявлениями, трансформацией в продуктивную стадию. Граница отторжения эпидермиса формировалась за счет воспалительного экссудата, локализовалась в зоне зернистого слоя. В состав детрита вовлекались компоненты волосяных воронок внутреннего корневого эпителиального влагалища, секрет сальных желез. В волосяных фолликулах истончались эпителиальные оболочки корня, снижалась секреторная активность себоцитов, уменьшался диаметр луковицы. В перифокальной зоне корней выявлялись локальные очаги отека, изоляции сумки волоса от прилежащей соединительной ткани.

Седьмые сутки опыта характеризовались проявлениями органотипической дифференцировки и образованием эпителиальных тяжей погружного роста. В составе эпидермального пласта при применении геля «Эйковит» выявлялись CD1-альфа-позитивные клетки и эпидермально-пролиферативные единицы (рис. 2).

Рис. 1. Контактный дерматит, 3-и сут опыта. Формирование детрита (1), зона отторжения.

Воспалительный экссудат (2), витальные слои эпидермиса (3). Фиксация 10 % нейтральным формалином. Визуализация при помощи пероксидазы. Содержание Ki-67-позитивных клеток. 100×10

Fig. 1. Contact dermatitis. Experiment, Day 3. Detritus formation (1), rejection zone.

Inflammatory exudate (2), vital layers of the epidermis (3). Fixation: 10 % neutral formalin.

Visualization with peroxidase. Ki-67 positive cells. 100×10

Рис. 2. Контактный дерматит, 7-е сут опыта. CD1-альфа-позитивные клетки в составе регенерата. Формирование эпидермальных пролиферативных единиц. Фиксация 10 % нейтральным формалином.

Визуализация при помощи пероксидазы. 100×10

Fig. 2. Contact dermatitis. Experiment, Day 7. CD1-alpha positive cells in regenerate. Formation of epidermal proliferative units. Fixation: 10 % neutral formalin. Visualization with peroxidase. 100×10

Выявление в составе эпидермального пласта CD3-клеток свидетельствовало о вступлении регенерата в стадию органотипической дифференцировки и полидифферонного состояния. Кожный вариант регенерации сопровождался поддержанием в составе эпителиальных компонентов высокого содержания

CD1-альфа и CD3 на всех последующих стадиях регенерации (табл. 1, 2).

Содержание Ki-67-позитивных клеток в эпидермальном пласте регенерата при воздействии температурного фактора представлено на рис. 3.

Таблица 1

Table 1

Содержание CD1-альфа / CD3-позитивных клеток в эпидермальном пласте регенерата, % (M±m)

CD1-alpha / CD3-positive cells in the epidermal layer of regenerate, % (M±m)

Сутки опыта Day of experiment	«Контактный дерматит» Contact dermatitis		«Термический ожог» Thermal burn
	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18
3-и Day 3	0	0	0	0
7-е Day 7	9,1±0,4 / 0,0	6,2±0,3 / 3,8±0,2	9,5±0,4 / 0	5,3±0,5 / 4,1±0,3
10-е Day 10	12,3±0,5 / 2,1±0,2	10,2±0,4 / 6,2±0,3*	10,3±0,5 / 4,3±0,2	8,4±0,1 / 9,2±0,3*
14-е Day 14	14,2±0,6 / 10,3±0,4	12,1±0,4 / 9,4±0,5	14,3±0,5 / 9,6±0,4	12,1±0,4 / 15,1±0,5*
20-е Day 20	12,3±1,1 / 16,4±0,4	10,2±0,3 / 17,3±0,6	15,4±0,4 / 15,2±0,3	12,4±0,5 / 19,2±0,7
30-е Day 30	11,6±0,4 / 19,1±0,3	11,7±0,3 / 18,6±0,4	12,4±0,4 / 18,3±0,6	12,7±0,6 / 20,2±0,4

Примечания: 1. * – статистически значимые отличия при сравнении с соответствующей группой, в которой не использовался «Эйковит», при p<0,046 (выполнена поправка Бонферрони в связи с попарным множественным сравнением).

• 2.    Содержание CD1-альфа в коже интактного животного составляло 9,4±0,3.

• 2.    The number of CD1-alpha cells in the skin of intact animals was 9.4±0.3.

  Содержание CD3-позитивных клеток в сосочковом слое регенерата

  
  

Note: 1. * – the differences are statistically significant when compared with the corresponding group without Eikovit (p<0.046) (Bonferroni correction).

Таблица 2

Table 2

CD3-positive cells in the papillary layer of regenerate

Сутки опыта Day of experiment	«Контактный дерматит» Contact dermatitis		«Термический ожог» Thermal burn
	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18
3-и Day 3	0	0	0	6,1±0,
7-е Day 7	21,2±0,6	40,3±1,2*	26,3±0,7	41,4±1,1*
10-е Day 10	23,3±0,7	40,2±2,1*	29,4±0,8	43,4±0,9*
14-е Day 14	27,4±0,6	42,1±1,1*	33,4±1,2	45,1±1,1*

Сутки опыта Day of experiment	«Контактный дерматит» Contact dermatitis		«Термический ожог» Thermal burn
	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18	Без «Эйковита», Without Eikovit n=18	С «Эйковитом», With Eikovit n=18
20-е Day 20	28,1±0,4	41,1±0,6*	35,7±1,1	45,2±1,3*
30-е Day 30	31,2±0,6	44,4±0,8*	36,2±0,8	48,3±0,9*

Примечания: 1. * – статистически значимые отличия при сравнении с соответствующей группой, в которой не использовался «Эйковит», при p<0,034 (выполнена поправка Бонферрони в связи с попарным множественным сравнением).

• 2.    Содержание CD3-позитивных клеток в коже интактного животного составляло 36,7±0,4.

• 2.    The number of CD3-positive cells in the skin of intact animals was 36.7±0.4.

Note: 1. * – the differences are statistically significant when compared with the corresponding group without Eikovit (p<0.034) (Bonferroni correction).

3 суток – Day 3   7 суток – Day 7  10 суток – Day 10 14 суток – Day 14 20 суток – Day 20 30 суток – Day 30

Тепло – Heat

Холод – Cold ^^^^^^^в Контроль - Control

Рис. 3. Содержание Ki-67-позитивных клеток в эпидермальном пласте регенерата при воздействии температурного фактора малой интенсивности

Fig. 3. The number of Ki-67 positive cells in the epidermal layer of regenerate under various temperatures

Согласно сведениям литературы у мышей экспрессия генов приводит к генерации белков в течение 20 мин [23–25]. Посттрансляционные модификации белка могут быть обратимы. Процессы расщепления и деградации

белка необратимы. Это важно учитывать при анализе состояния биологии клетки. Во многих типах клеток эффекторное действие стимуляторов характеризуется пульсирующей формой с периодом смены в несколько минут,

что может отразиться на финальном этапе транскрипционно-ретрансляционного конвейера [26].

Длительная стимуляция слабой интенсивности на уровне субстратов межуточного обмена может привести к адаптации либо к ответу слабой интенсивности, не исключается также колебательный ответ, т.е. индуцированная колебательная активность. К сожалению, выявление динамических процессов в многоклеточном организме ограничено из-за технологических условий на механическом уровне. Поэтому использование различных модельных систем, позволяющих приблизиться к расшифровке сигнальных активностей клеток, оправдано и широко используется при изучении процессов цито-, гисто- и эмбриогенезов [27, 28].

Внутриклеточные сигнальные каскады включают ферментативные реакции, посттрансляционные модификации, протеолитические деформации и осуществляются стремительно – в течение секунды-минуты [27, 28].

Чаще всего такие процессы приводят к активации факторов транскрипции, которые перемещаются в ядро и вызывают экспрессию генов. Передача сигналов часто пульсирует в течение нескольких минут из-за периодичности динамики фосфорилирования-дефосфорилирования. В клетках кожи мыши период импульса варьирует от 30 мин до 1,5 ч. Пульсирующая активность коррелирует с уровнем пролиферации клеток кожи [27, 28].

Во всех сериях реализовался генетически закрепленный механизм репаративной регенерации, прохождение провизорной и дефинитивной стадии тканево- и органотипической дифференцировки. Показателем прогрессивных восстановительных процессов стало наблюдение за уровнем пролиферативной активности клеток в эпидермальном компоненте регенерата (рис. 4).

Основанием для оценки состояния пролиферации послужила визуализация топики Ki-67 (рис. 5).

3 суток – Day 3   7 суток – Day 7  10 суток – Day 10 14 суток – Day 14 20 суток – Day 20 30 суток – Day 30

Химический ожог без Эйковита – Chemical burn without Eikovit

Химический ожог с Эйковитом – Chemical burn with Eikovit

Термический ожог без Эйковита – Thermal burn without Eikovit

^^^^Термический ожог с Эйковитом – Thermal burn with Eikovit

Рис. 4. Демонстрация уровня пролиферативной активности клеток во всех сериях опыта (по уровню белка Ki-67) в эпидермальном пласте кожного регенерата при химическом и термическом факторах поражения

Fig. 4. The level of proliferative cell activity at all stages of the experiments (Ki-67 protein level) in the epidermal layer of the skin regenerate under chemical and thermal burns

Рис. 5. Термический ожог кожи, 20-е сут опыта, использование геля «Эйковит». Ki67-позитивные клетки в составе регенерирующего эпидермиса (1).

Фиксация 10 % нейтральным формалином.

Визуализация при помощи пероксидазы. Окраска гематоксилином Майера. 90×7

Fig. 5. Thermal burn. Experiment, Day 20. “Eykovit” gel. Ki67 positive cells in regenerating epidermis (1). Fixation: 10 % neutral formalin. Visualization with peroxidase. Mayer's hematoxylin staining. 90×7

Стадия 7–10-х сут характеризовалась качественными преобразованиями регенерата, трансформацией из провизорного в дефинитивное состояние.

Выявление в составе эпидермального пласта CD31-позитивных клеток стало морфологическим показателем заживления дефекта по дермальному типу и формирования рубца. Реализация биологических компетенций клеток в сериях с применением геля «Эйковит» осуществлялась раньше, чему способствовала активизация липофильного варианта трансмембранного поступления в клетки полиненасы-щенных жирных кислот, содержащихся в препарате. Эти кислоты, включаясь в систему межуточного обмена, ингибируют фосфолипазы, встраиваются в билипидный слой мембран, участвуют в регенерации биомембран, выполняя роль липидных сшивок, инициируют прерывание свободнорадикального окисления.

Органогенез сальных желёз осуществлялся в виде двух хроноэтапов, первый из которых (10–14 сут) сопровождался формированием свободно открывающихся на поверхность восстановленного эпидермиса желёз. Выделенное кожное сало санировало регене-

рирующую поверхность, обеспечивало эластичность и предотвращало формирование трещин. Второй этап формирования сальных желёз совпал по времени с формированием зачатков волос и начался после 20 сут регенерации.

К 14-м сут эпидермальный пласт находился в состоянии тканево-типической дифференцировки, ороговевшие кератиноциты были представлены отдельными участками и не формировали непрерывного защитного слоя. Зачатки сальных желёз в опытах с применением геля «Эйковит» вступали в стадию железистой дифференцировки: в них образовались секреторные отделы и выводные протоки.

К 20-м сут эпидермальный пласт характеризовался наличием камбиальных и дифференцированных слоёв. При контактном дерматите хроновектор процесса репарации запаздывал по сравнению с термическим ожогом и кожной раной, отсутствовали зачатки дериватов, заживление дефекта происходило по дермальному типу.

К 30-м сут обеспечивалась реституция поражённого участка кожи в зоне раневого дефекта и после термического ожога. Следует отметить, что активность процессов репара-

тивной регенерации кожи и её дериватов контролировалась состоянием локальных регуляторных факторов. Одним из объективных показателей морфогенеза кожного регенерата являлся хроновектор конвергенции и плотность иммунокомпетентных клеток в составе эпителиального и мезенхимального компонентов на стадиях регенерации. Хроновектор

вовлечения в состав эпидермального компонента клеток CD1-альфа и CD3 декларировал стартовое состояние кожного типа регенерации и реституции пораженного участка. Выявление в составе эпидермального пласта регенерата CD31-позитивных клеток может рассматриваться как предиктор субституции (рис. 6).

Рис. 6. Содержание CD31-позитивных клеток в эпителиальном компоненте формирующегося кожного регенерата

Fig. 6. CD31-positive cells in the epithelium component of skin regenerate

Выводы:

• 1.    Хроновектор конвергенции иммунокомпетентных клеток при заживлении дефектов кожи является критерием реституции эпидермального и соединительнотканного компонентов регенерата и дериватов кожи – сальных желёз и волос. Соблюдение отмеченного хроновектора обеспечивает становление провизорного регенерата и его дальнейшую трансформацию в дефинитивное состояние.

• 2.    Одним из итогов десинхроноза конвергенции может быть заживление по дермальному варианту и субституция.

• 3.    Полемика по поводу провизорного / дефинитивного состояния кожного регенерата продолжает страницу обсуждения «об интерференции детерминаций» и «презумпции про-визорности» [14, 29].

Работа выполнена при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации в рамках гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых (номер контракта МК-2804.2022.3).