Морфологическая характеристика гепатоцитов у 6-месячных телят породы красная степная в стандартных условиях содержания и при введении в рацион ЭМ-Курунги

В настоящее время большое внимание уделяется вопросам получения животноводческой продукции, отвечающей современным требованиям, и в первую очередь экологической безопасности [3]. Используемые в животноводстве и ветеринарии химиотерапевтические препараты для лечения и профилактики болезней, а также различные биологические добавки, стимулирующие продуктивность животных, зачастую не только не дают желаемого эффекта, но и далеко не безопасны [2]. Таким образом, актуальным является поиск альтернативных эффективных путей повышения биорезистентности продуктивных животных, переход от химического к органическому сельскому хозяйству. В этом отношении особого внимания заслуживают пробиотические препараты, созданные на основе полезных бактерий, которые активно участвуют в пищеварении и в подавлении патогенной микрофлоры, заселяющей кишечник. ЭМ-технологии (ЭМ – эффективные микроорганизмы) рассматриваются как одно из наиболее перспективных направлений прикладного характера в области биотехнологии. Особо важную роль эффективные микроорганизмы играют в профилактике болезней сельскохозяйственных животных, прежде всего молодняка, как наиболее уязвимого звена в животноводстве.

Цель – изучить морфологию гепатоцитов и тинкториальные свойства печени 6-месячных телят породы красная степная в стандартных условиях содержания и при введении в рацион концентрата кормового «ЭМ-Курунга» с использованием программы ImageJ 1.46.

Материал и методы исследования

Исследование проведено на телятах породы красная степная в 2013 г. на базе ООО «Омсксельхозпродукт». Сформированы две группы животных: опытная (n = 25) – в ежедневный рацион введен кормовой концентрат «ЭМ-Курунга»; контрольная группа (n = 25) – животные с обычным стандартным рационом.

Путем пункционной биопсии с соблюдением правил асептики и антисептики, с предварительным проведением местной инфильтрационной анестезии 0,25%-ным раствором лидокаина с помощью автоматического биопсийного инструмента SuperCore фирмы Angiotech забирался столбик печени длинной 5–10 мм. При взятии биопсии печени прокол осуществлялся с правой стороны в области 11-го межреберья на 2–3 см ниже линии маклока. У взрослых животных, согласно имеющимся рекомендациям, игла вводится в направлении левого плечелопаточного сочленения. Учитывая топографические особенности расположения печени у растущих животных (молодняк крупного рогатого скота), иглу вводили медленно, перпендикулярно поверхности кожи на глубину 2–3 см [6; 8].

Печень фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «Биовитрум» (Санкт-Петербург). Материал заливали в парафин по общепринятой методике [5; 7]. На ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee, Германия) готовили срезы толщиной 3–5 мкм, размещали на стандартных по толщине предметных стеклах, окрашивали гематоксилином и эозином. После окраски срезы заключали в синтетическую среду BioMount и покрывали стандартными покровными стеклами. Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Imager. Z1 с встроенным ТV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl AxioCam MRс 5, окуляр W-PI 10x/23, объективы: A-Plan 5x/0.12; EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27; EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27; EC Plan-Neofluar 40x/0.75 M27; EC Plan-Neofluar 100x/1.30 Oil M27. Морфометрический анализ проводили согласно общепринятым рекомендациям [1] с использованием программы ImageJ 1.46. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica for Windows (Версия 6.0, StatSoft, Inc.). Различия между независимыми выборками определяли с помощью двухвыборочного критерия Манна-Уитни, для категориальных переменных и множественного сравнения использовался критерий χ 2 [4]. Нулевая гипотеза отвергалась, а альтернативная принималась при p < 0,05.

Результаты исследований

Установлено, что параметры, характеризующие структурно-функциональное состояние паренхимы печени у животных обеих групп, варьировали в рамках физиологической нормы. Признаков дистрофических и некробиотических очаговых изменений не выявлено. Различия, обнаруженные в ходе морфометрического исследования, в основном касались содержания гранул гликогена, количества многоядерных гепатоцитов, фигур митоза и клеток Купфера. У животных основной группы значения вышеназванных показателей были статистически значимо выше соответственно на 25,5, 12,4, 10,5 и 8,6% (критерий Манна-Уитни, p < 0,05).

Однако морфологические изменения в печени при использовании препарата не ограничивались только найденными морфометрическими сдвигами. Необходимо учитывать то, что ткань печени неоднородна по своей структуре и представляет собой совокупность модулей (надклеточных интегрированных компартментов) – долек, являющихся функционально целостными самостоятельными элементами с детерминированными межклеточными взаимоотношениями, определяющими их функцию. Любые внешние и внутренние воздействия приводят к тому, что существующие в норме строгие функциональные взаимосвязи между каждым из составляющих модуля (гепатоциты, клетки Купфера, клетки крови, триады, центральные вены) изменяются. Эти изменения могут отражать активацию адаптивных или патологических процессов. В зависимости от последнего меняется и сбалансированная работа печеночной паренхимы.

Поэтому любая информация о сдвиге каких-либо параметров, включая и тинктори-альные свойства составляющих модуля, в любом направлении позволяет судить о переходе на другой уровень работы или о дестабилизации функциональных систем печени. Изменения тинкториальных свойств ткани печени, содержащей преимущественно печеночные клетки, как правило, выявляются раньше структурных и поэтому могут отражать начальные этапы активации патоморфоза или компенсаторного гистогенеза в печени.

Программа ImageJ 1.46 позволяет с помощью построения гистограмм распределения пикселей осуществить описание тинкториальных изменений ткани печени количественными показателями, выявить временные и пространственные закономерности их развития на малых и больших увеличениях.

С этих позиций нами установлено, что ткань печени животных основной группы, незначительно отличающаяся по классическим морфометрическим параметрам от таковой группы сравнения, приобретала явные отличия при построении гистограмм в различных спектрах.

Было выявлено, что при использовании «ЭМ-Курунги» на 8-битовых гистограммах распределения серого цвета происходит сдвиг максимальной яркости окраски от триады, а также увеличение яркости пика почти в 1,2 раза по сравнению с группой сравнения. Кроме того, выявлялось статистически значимое (критерий χ 2 = 35,6, df = 12 p = 0,001) различие относительного содержания основных групп пикселей, отражающих синий, зеленый и красный цвета. Эти данные свидетельствуют о возможности получения ранее недоступной информации при использовании автоматического анализа графических объектов с помощью программы ImageJ 1.46. Полученные количественные данные о тинкториальных свойствах ткани печени позволяют свидетельствовать о различии функциональной активности гепатоцитов сравниваемых групп 6-месячных телят красной степной породы, а также о меньшей вероятности развития в основной группе цитотоксических и фибропластических процессов.

Таким образом, прижизненное гистологическое исследование структуры и тинктори-альных свойств печени телят при обычном рационе и использовании «ЭМ-Курунги» позволило установить наличие статистически значимых различий по ряду количественных параметров, отражающих структурно-функциональное состояние печени на клеточном и тканевом уровнях. Обнаруженные различия целесообразно также интерпретировать как отражение внутри- и междифферонных (модульных) различий строения печени при использовании пробиотиков. Вполне вероятно, что «ЭМ-Курунга» активирует биоэнергетические и биосинтетические процессы в печени, изменяет взаимоотношения клеток различных дифферонов в гистионе, целенаправленно повышая компенсаторно-восстановительные возможности печеночных клеток 6-месячных телят красной степной породы.