Морфологические и иммуногистохимические особенности селезенки крыс после иглоукалывания

Введение. Одной из острых проблем медицины являются иммунодефицитные состояния. В этом плане представляет интерес акупунктурное воздействие – метод, улучшающий работу иммунной системы и увеличивающий резервные возможности организма [1, 2]. Перспективность иглоукалывания заключается во взаимоувязан- ной коррекции состояния нервной и иммунной систем, в выраженной его терапевтической эффективности [3]. Так иглоукалывание в точки ST 36, LI 4, LI 11, достоверно увеличивает уровень Ig G, Ig M, Ig A, IL 4, IL 6, IL 10, C 3, C 4, CD4+, CD8+, INF gamma в сыворотке крови человека [9, 10]. Инструментами адаптивной иммунной системы служат Т- и В- лимфоциты [4]. Ранее было показано, что под влиянием ИУ в точки LI 11 и GV 14 изменяется обеспеченность нейромедиаторами цитоструктур селезёнки [5]. Однако клеточный и субпопуляционный состав лимфоцитов селезёнки изучены недостаточно. Результаты такого исследования необходимы как для понимания общих закономерностей действия всех звеньев иммунной системы после действия акупунктуры, так и для создания морфологических основ эффективности акупнуктурного рецепта.

Цель исследования: изучить особенности структурной перестройки селезёнки крыс, а также локализацию и распределение CD4+ и CD8+ лимфоцитов на разных сроках после иглоукалывания в акупунктурные точки, обладающие иммунорегу-ляторной активностью.

Материалы и методы. Исследования были проведены на 61 белых беспородных крысах-самцах в осенний период. Для окраски полихромным толуидиновым синим по А. Унна и гемотоксилин-эозином использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм. Для выявления субпопуляций CD4+ и CD8+ применяли иммуногистохимические методики с применением соответствующих моноклональных антител.

Выделяли 3 группы животных: 1-я – интактная (N=5); 2-я – контрольная – крысы (N=28), которым воздействовали акупунктурной иглой в течение 10 мин рядом с точкой акупунктуры, где электрокожное сопротивление (ЭКС) составляет более 100 кОм; 3-я – крысы (N=28), которым проводили иглоукалывание в течение 10 мин в точки акупунктуры меридиана толстого кишечника LI 11, обладающей иммуномодулирующим эффектом, и заднесрединного меридиана GV 14, являющуюся стимулятором симпатической нервной системы [2], где ЭКС составляет 55—65 кОм. Селезенку извлекали через 15 мин, 1, 2 и 4 ч после иглоукалы-

Таблица 1

Морфометрические показатели лимфоидного фолликула (ЛУ) селезенки крыс после иглоукалывания (ИУ) в разные сроки в мкм (M±m)

Группы животных Исследуемые показатели	Интактная группа	Через 15 мин после ИУ	Через 2 ч после ИУ	Через 4 ч после ИУ
	№=5	№=7	№=7	№=7
Диаметр поперечного среза ЛУ	363,3±37,52	442,1±16,16*	451,4±30,93*	405,8±23,67
Диаметр продольного среза ЛУ	311,7±21,36	304,4±24,54	334,3±21,94	386,9±36,42*

Примечание: ИУ – иглоукалывание; * p<0,05 по сравнению с показателями предыдущего срока

вания. Забой и взятие материала осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13.11.1984 г. № 724). Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statistica 6. Достоверность различий между опытной и интактной группой оценивали по t-критерию Стьюдента и критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Через 15 мин после 10-мин ИУ в селезёнке крыс появляются лимфоидные узелки, имеющие отростчатую форму, размеры лимфоидных узелков увеличиваются (табл. 1). Число митозов в центре размножения резко увеличилось – в 3,4 раза (табл. 2). У лимфоцитов периартериальной зоны лимфоидного узелка вокруг ядра выявляется темно-синий узкий ободок, что свидетельствует о начинающейся бласттрансформации [6]. Часть лимфоцитов маргинальной зоны становятся ме-тахроматичными.

Для красной пульпы селезенки характерна полиморфная окраска. Здесь расположены лимфоциты с бледной и более яркой цитоплазмой, последние иногда образуют «розетки». Вдоль трабекул располагаются тяжи из лимфоцитов. В красной пульпе расположены много макрофагов разнообразной формы с числом 1,11±0,42 размером 7-15 мкм, включающих 8,6±0,6 гранул;

определяются мегакариоциты с многолопастным ортохромным ядром и неокрашенной цитоплазмой. В трабекулах увеличивается васкуляризация.

У контрольных крыс, получавших иглоукалывание вне точек акупунктуры, в лимфоидном узелке увеличилось число клеток с картинами деструкции от единичных клеток на отдельных препаратах до 3,2 %, по сравнению с интактными, подобная картина наблюдалась у крыс при стрессе [7]. В красной пульпе появлялись расширенные венозные синусы. Другой отличительной особенностью контрольных крыс является наличие клеточного вала в красной пульпе около маргинального синуса.

Через 1 ч после ИУ в лимфоидных узелках зональность была менее выражена. Увеличилось число макрофагов в 1,2 раза в лимфоидном узелке, по сравнению с данными интактной группы животных. Содержание клеток с картинами митозов возросло в 2 раза, число эозинофилов уменьшилось в 1,6 раза. Лимфоидные узелки обладают более светлой ортохромной окраской по внешнему контуру, граничащему с красной пульпой. Лимфоциты красной пульпы окрашены неравномерно, ортохромно. В межузелковой ткани хорошо выявляются кровеносные сосуды. В белой и, особенно, в красной пульпе имеются округлые, неокрашенные жировые капли разного

Таблица 2

Цитологические показатели селезенки крыс после иглоукалывания (ИУ) на разных сроках эксперимента (M±m)

	Интактные	15 мин после ИУ		2 ч после ИУ		4 ч после ИУ
		Контроль	Опыт	Контроль	Опыт	Контроль	Опыт
Эозинофилы красной пульпы	1,61± 0,08	1,43±0,07	1,16±0,09*	1,47±0,05	1,42±0,06*	1,55±0,04	1,51±0,08
Мегакариоциты красной пульпы	2,32± 0,07	2,39±0,09	2,52±0,09	2,52±0,07	3,14±0,08*	3,12±0,09	7,00±0,15*
Плазмоциты	0,81± 0,03	0,91±0,04	1,31±0,09*	0,86±0,05	2,12±0,09*	0,79±0,07	1,41±0,07*
Митотически делящиеся клетки лимф. узелка	4,56± 0,34	4,9±0,29	15,62±1,04*	4,85±0,37	9,81±0,47*	4,45±0,53	6,61±0,79*

Примечание: ИУ – иглоукалывание; * p<0,05 по сравнению с показателями предыдущего срока

размера.

Морфологическая картина контрольных животных не отличается от наблюдаемой в норме.

Через 2 ч после ИУ лимфоидные узелки имели неправильную отростчатую форму. Размеры лимфоидных узелков на этом сроке достигли своего максимума (табл. 1). Число плазмоцитов увеличилось более, чем в 2,5 раза, по сравнению с контрольными показателями. Лимфоциты, окружающие центральную артерию, приобретают более интенсивную ортох-ромную окраску по ободку клетки. Число митотически делящихся клеток в центре размножения снижается, но по-прежнему превышает таковое у интактных животных, число макрофа- гов красной пульпы в 1,6 раза больше, чем у контрольных крыс. В маргинальной зоне лимфоциты образовывали плотные тяжи из 20-25 клеток. Непосредственно под капсулой селезенки распола-

Рис. 1. Красная пульпа селезёнки интактных крыс. Cтрелками показаны CD4-иммунопозитивные лимфоцитs. Иммуногистохимическая реакция на CD4-позитивные лимфоциты. Ув. 400.

узелки имели неправильную форму, разные размеры, часть из них сливалась между собой. В ряде лимфоидных узелков определялся выраженный реактивный центр и чёткое деление на гались скопления мелких лимфоцитов. За ними выявлялась светлая полоса, где оголялась ретикулярная строма красной пульпы. По-видимому, происходит массивный выброс лимфоцитов в кровь. Число МКЦ увеличивалось в 1,5 раза по сравнению с предыдущим сроком. В красной пульпе выявляются нечетко оформленные группы лимфоцитов, возможно, размножающиеся клетки — до 1-2 в о. п. з.

В срезах контрольных животных отмечается системное расширение венозных сосудов красной пульпы. Число МКЦ красной пульпы статистически достоверно не отличалось от значений интактных животных.

Через 4 ч после иглоукалывания лимфоидные

Рис. 2. Красная пульпа селезёнки крыс через 1 ч после 10-минутного иглоукалывания в акупунктурные точки LI 11 и GV 14. Cтрелками показаны CD4-иммунопозитивные лимфоцитs. Иммуногистохимическая реакция на CD4-позитивные лимфоциты. Ув. 400.

зоны, что может объясняться содержанием в них высокодифференцированных Т- и В-клеток. Число плазмоцитов уменьшилось, но по-прежнему превышало таковое у интактных животных. По-видимому, ИУ стимулирует гуморальный иммунитет: усиливает антигензависимую дифференцировку и образование плазмоцитов. Число митозов снизилось в 1,4 раза по сравнению с предыдущим сроком, но не достигло первоначальных значений (табл. 2). Сохраняется тяжистость лимфоцитов в лимфоидном узелке.

Около сосудов образуются группы плазмоцитоподобных клеток (2±0,3 на о. п. з.). В красной пульпе усиливается созревание мегакариоцитов (МКЦ), число МКЦ увеличилось в 3,1 раза. Впервые в красной пульпе появляются единичные лимфоциты и липоциты с -метахромазией. В срезах селезенки контрольных животных наблюдается расширение объёма лимфоидного узелка.

При исследовании иммуногистохимическими методами выявлено, что СD4-лимфоциты локализуются, в основном, под капсулой и вблизи трабекул, а также в реактивном центре лимфоидного узелка; CD8-позитивные клетки локализуются, в основном, в толще красной пульпы, под капсулой и вблизи трабекул. Число CD4-позитивных спле-ноцитов достигает максимума через 15 мин после иглоукалывания в мантийной зоне лимфоидного узелка и толще красной пульпы, и сохраняется повышенным более чем в 2 раза к концу опыта. В периартериальной лимфоидной муфте, реактивном центре лимфоидного узелка и в маргинальной зоне максимальное число CD4-позитивных спленоцитов выявлено через 2 ч после процедуры.

Изменение числа CD8-позитивных спле-ноцитов красной пульпы носило волнообразный характер. Через 15 мин число CD8-позитивных спленоцитов достоверно снижается более чем в 2 раза по сравнению с интактной группой, через 1 ч – увеличивается более чем в 3 раза, через 2 ч вновь снижается, но остается выше по сравнению с интактной группой. Это может свидетельствовать об активации иммунокомпетентных клеток и формировании системной иммунной реакции [8]. В периартериальной лимфоидной муфте и в маргинальной зоне максимальное число CD8-позитивных спленоцитов выявлено через 2 ч после процедуры.

Таким образом, процессы, идущие в селезёнке крыс, подвергнутых иглоукалыванию, свидетельствуют о специфическом его воздействии. Ранее было принято считать, что реализуется иммунорегулирующий компонент акупунктуры прежде всего через центральные органы кроветворения и иммуногенеза – тимус и костный мозг [1, 2]. Проведенные исследования показали, что уже через 15 мин после ИУ происходят структурная перестройка белой пульпы, ведущая к усилению дифференцировки и пролиферации иммунокомпетентных клеток, участвующих, в первую очередь, в гуморальном ответе.И только в впоследствии изменения затрагивают клетки красной пульпы селезёнки.