Морфологические и молекулярно-генетические предикторы рецидива лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста после органосохраняющего лечения

Введение. Лейомиома матки (ЛМ) является заболеванием, склонным к прогрессированию, росту и рецидивированию. Так, по данным M.P. Radosa et al., после лапароскопической миомэктомии риск рецидива составляет 4,9 % через 24 мес. и 21,4 % через 60 мес. после операции. Возраст женщины 30–40 лет и наличие более чем одного узла ЛМ на мо- мент первичной лапароскопической миомэктомии были определены как факторы, значительно повышающие риск симптоматического рецидива ЛМ (31,25 % и 38,71 % соответственно, p<0,01) [1]. Y. Kotani et al. показали, что кумулятивная частота рецидивов ЛМ через 8 лет после миомэктомии составляет 70– 80 % [2]. Согласно наблюдениям Verena M.C.

Reichert et al. случайное удаление лейомиосаркомы матки влияет на выживаемость без рецидивов, но не оказывает негативного влияния на общую выживаемость [3].

С учетом высокой распространенности ЛМ у женщин репродуктивного возраста и мультифакторности заболевания прогнозирование риска рецидива опухоли в настоящее время является одной из ключевых задач, решение которой смогло бы улучшить не только качество жизни пациенток, но и снизить риск развития осложнений беременности после миомэктомии. Однако в настоящее время подобные прогностические модели представлены лишь в единичных публикациях.

Патентный поиск за последние 7 лет показал, что в отечественной литературе способ прогнозирования рецидива ЛМ представлен лишь в работе М.Г. Николаевой с соавт. [4]. Безусловно, он вызывает заслуженный практический интерес, однако применим лишь в случае использования в качестве метода лечения эмболизации маточных артерий.

Имеющаяся зарубежная прогностическая модель (X. Ming et al.) включает в расчет такой клинический показатель, как наличие эндометриоза. Это либо сужает область применения модели (только для сочетанной патологии), либо требует уточнения, насколько универсальным является этот фактор для всех случаев рецидива ЛМ [5].

Фундаментальные механизмы развития заболевания остаются не до конца ясными и дискуссионными (контраверсионными), что затрудняет поиск мишеней для терапии. Роль микроРНК в механизмах рецидивирования ЛМ изучена недостаточно, хотя их идентификация открывает перспективы для разработки новых методов лечения и профилактики повторного роста узлов. Это особенно актуально для тех пациентов репродуктивного возраста, хирургическое лечение которых может являться малоэффективным. Целенаправленная терапия также может предотвратить рецидивирование миомы матки, а следовательно, повторное хирургическое вмешательство.

Таким образом, радикальное лечение ЛМ (гистерэктомия) неприемлемо для женщин, планирующих беременность, а другие методы не всегда эффективны и не предотвращают рецидивы.

Цель исследования. Установить морфологические и молекулярно-генетические детерминанты рецидивирующей лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста.

Материалы и методы. Обследовано 75 женщин, оперированных по поводу ЛМ: 52 без рецидива и 23 с рецидивом. Рецидивом считалось возникновение ЛМ у женщин, которые уже перенесли миомэктомию на момент включения в исследование, либо обнаружение миоматозных узлов на контрольном осмотре через 1 год после произведенной миомэктомии.

С целью определения предикторов реци-дивирования ЛМ участки удаленного миометрия и миоматозные узлы после операции были направлены на морфологическое, иммуногистохимическое (VEGF, TGF-β) и молекулярно-генетическое (микроРНК: Let 7, miR-92a, miR-146b) исследование.

Материал для гистологической и иммуногистохимической оценки фиксировался в 10 % забуференном формалине. Фиксация и гистологическая проводка выполнялись по стандартным протоколам. Затем материал заливался в парафин, из полученных парафиновых блоков изготавливались серийные срезы толщиной 4–5 мкм. Для гистологического исследования срезы были окрашены гематоксилином и эозином.

Измерение уровней экспрессии микроРНК (Let 7, miR-92a, miR-146b) методом ПЦР в реальном времени проводили на ам-плификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Данный этап был выполнен в ФГБУН Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения РАН в лаборатории молекулярной генетики отдела структуры и функции хромосом (заведующий лабораторией – доктор биологических наук А.В. Вершинин).

Для создания базы данных и математической обработки был применен пакет модулей IBM SPSS STATISTICS v.26.0 for Windows (IBM Corporation, Somers, USA), Jamovi version 1.2.27, StatTech v.1.2.0 (номер регистрации 2020615715).

Результаты. Результаты морфологических и молекулярно-генетических исследований позволили установить возможные предикторы рецидивирующей ЛМ. Ключевыми макроскопическими факторами являются увеличение размеров матки до 10–15 нед. (73,9 % пациенток с рецидивом против 46,2 % больных с первичной ЛМ, р=0,052), диаметр наибольшего миоматозного узла 60–80 мм (у 65,2 % против 36,5 % женщин соответственно, р=0,051), быстрый рост новообразования – до 6 мес. (17,4 % больных против 9,6 % соответственно, р=0,051).

Микроскопическими предикторами можно считать снижение гиалиноза (34,8 % пациенток с рецидивом против 65,4 % без такового, р=0,044), уменьшение отека стромы (13,0 % женщин против 25,0 % соответственно, р=0,024), увеличение фибриноидного некроза в 2 раза (30,4 % больных против 15,4 % соответственно, р=0,027), частые зоны роста (69,6 % пациенток против 57,7 % соответственно, р=0,033). Выявлена прямая корреляционная зависимость между количеством узлов и гиалинозом (r=0,452, p=0,001).

Среди иммуногистохимических предикторов рецидива ЛМ необходимо указать ангиогенные факторы: увеличение концентрации VEGF (88,5 % женщин с рецидивом против 39,1 % с первичной ЛМ) в рецидивирующих узлах и гиперэкспрессия TGF-β (57,1 % против 24,0 % женщин соответственно), способствующая стимуляции фиброза. То есть рост ЛМ после миомэктомии связан с высокой экспрессией факторов роста (TGF-β, VEGF), что приводит не столько к пролиферации ЛМ, сколько к ее гипертрофии.

Таким образом, источниками рецидива ЛМ являются периваскулярные «зачатки» ЛМ в миометрии, микроскопические остаточные узлы и рубцовые изменения после миомэктомии, а критериями агрессивного течения – быстрый рост и множественные узлы (6 тип по FIGO), преобладание фибриноидного некроза над гиалинозом, а также высокая плотность зон роста.

Дисбаланс микроРНК (увеличение экспрессии Let-7 (2,73 против 1,85 отн. ед.), miR-92a

(1,63 против 1,45 отн. ед.) и снижение экспрессии miR-146b (0,59 против 0,73 отн. ед.)) играет ключевую роль в патогенезе рецидивирования ЛМ после органосохраняющих операций.

Таким образом, рецидивирующие лейомиомы – это не случайные новые узлы, а проявление системной биологической предрасположенности миометрия к опухолевой трансформации. Основными факторами, оказывающими влияние на рецидив лейомиомы матки в репродуктивном возрасте после органосохраняющего лечения, являются генетическая предрасположенность и остаточные клетки после миомэктомии. Патогенез рецидива ЛМ после миомэктомии представляет собой последовательный каскад нарушений, начинающийся на молекулярном уровне и завершающийся клиническими проявлениями на органном уровне.

С учетом выбора тактики хирургического лечения пациенток с впервые выявленной ЛМ, а также прогноза риска развития рецидива и вероятности успеха его преодоления была разработана и обоснована персонифицированная модель морфологических и молекулярно-генетических предикторов ре-цидивирования лейомимы матки в репродуктивном возрасте. В прогностическую модель включены возможные морфологические, молекулярно-генетические детерминанты рецидива ЛМ.

P=1/(1+e-Z)×100 %.

Z=-15,4+5,13×X микроРНК-let7 –4,8×X микроРНК-92а –

33,2×X микроРНК-146b +14,8×X VEGF в узле +5,6×

XTGF-β в узле+3,2×X гиалиноз–4,8×Xразмеры матки +1,4×Xразмер миоматозного узла+4,3×Xскорость роста узла, где: P – вероятность рецидива ЛМ (%), e – число Эйлера – математическая константа (≈2,718), z – score – линейный предиктор всех факторов риска, Xразм. матки – размер матки (нед.); Xразм. миом. узла – размер миоматозного узла (мм); Xск.рост.узла – скорость роста узла (на 2 см за 12 мес.), Хгиалиноз –замещенная ткань (%), XTGF-β – TGF–β (% позитивных клеток H-score, 0–300), XVEGF – VEGF (% позитивных клеток H-score, 0–300), XмикроРНК-146b – экспрессия микроРНК-146b в миоматозном узле (отн. ед.), XмикроРНК-let7 – экспрессия мик-роРНК-Let7 в миоматозном узле (отн. ед.), XмикроРНК-92а – экспрессия микроРНК-92а в ми-оматозном узле (отн. ед.).

ROC-кривая прогнозирования риска рецидива ЛМ, построенная на основе морфологических и молекулярно-генетических предикторов, представлена на рис. 1.

Рис. 1. ROC-кривая прогнозирования риска рецидива ЛМ, построенная на основе морфологических и молекулярно-генетических предикторов

Fig. 1. ROC curve for predicting the risk of LM recurrence based on morphological and molecular genetic predictors

Площадь под ROC-кривой, соответствующая взаимосвязи прогноза рецидива ЛМ и значения логистической регрессионной функции, равнялась 0,99±0,011 (95 % ДИ 0,97–1,0). Пороговое значение функции P в точке cut-off составляло 0,4. Значения, равные или превышающие указанное, соответствовали высокому риску рецидива ЛМ. Чувствительность модели составила 95,5 %, специфичность – 97,6 %.

Обсуждение. Проблема рецидивирования лейомиомы матки после органосохраняющих операций остается одной из наиболее дискуссионной в гинекологии [6]. Наше исследование было направлено на поиск морфологических и молекулярно-генетических предикторов рецидива, что позволило не только выявить группу риска, но и обосновать патогенетические механизмы повторного роста опухоли. Полученные результаты демонстрируют высокую прогностическую значимость разработанной модели, что требует их сопоставления с актуальными научными данными [7–9].

Нами было подтверждено, что агрессивный фенотип ЛМ, склонной к рецидиву, характеризуется определенными макроскопическими чертами: тенденцией к увеличению размеров матки и диаметра доминантного узла, а также быстрым ростом. Эти наблюдения согласуются с выводами крупного ретроспективного исследования [10], в котором диаметр и множественность узлов включены в финальную номограмму для прогнозирования рецидива. Авторы также подчеркивают важную роль семейного анамнеза и наличия резидуальных узлов, что коррелирует с нашей концепцией о роли микроскопических остаточных «зачатков» в миометрии. Однако если в работе Emmanuel N Kontomanolis et al. подслизистая локализация узла рассматривалась как протек-тивный фактор [11], то в нашем исследовании акцент сделан на интерстициальные и субсерозные узлы (включая FIGO 6 тип), что указывает на различную этиологию рецидивов в зависимости от исходного типа роста опухоли.

Гистологическое исследование позволило выявить ключевые микроскопические маркеры неблагоприятного прогноза. Снижение гиалиноза и отека стромы на фоне двукратного увеличения частоты фибриноидного некроза и зон роста указывает на преобладание процессов пролиферации над инволютивными изменениями. Эти данные расширяют классические представления о патоморфозе ЛМ, предлагая рассматривать соотношение некроза и гиалиноза в качестве диагностический критерия агрессивности.

Центральным звеном предложенного нами патогенеза рецидива является дисбаланс факторов роста (гиперэкспрессия VEGF и TGF-β), ведущий не столько к гиперплазии, сколько к гипертрофии гладкомышечных клеток и фиброзу. Так, в обзоре М.И. Ярмолинской и соавт., посвященном опухолям матки, особое внимание уделено сигнальным путям, участвующим в регуляции основных клеточных процессов, возникновении и прогрессировании заболевания. Отмечено, что значимую роль в развитии миомы матки играет активация таких сигнальных путей, как Wnt/β-катенин, MAPK/ERK, TGF-β/SMAD [12].

Наше исследование вносит существенный вклад в понимание роли микроРНК при ЛМ. Выявленный нами дисбаланс (повышение экспрессии Let-7, miR-92a и снижение miR-146b) является одним из первых описаний специфического рецидивассоциированного профиля микроРНК для доброкачественной патологии. Эти данные перекликаются с выводами Ni et al., которые показали, что повышение уровня онкогенной miR-499a-5p в клетках ЛМ активирует Wnt/β-катениновый сигнальный путь, способствуя пролиферации и миграции клеток. Важно подчеркнуть, что если в злокачественных опухолях (uLMS) наблюдается супрессия семейств miR-29 и miR-200, то паттерн рецидивирующих лейомиом иной, что подтверждает их доброкачественную, но биологически активную природу [13–15].

Разработанная нами прогностическая модель объединяет все выявленные разноуровневые предикторы. Высокие показатели чувствительности (95,5 %) и специфичности (97,6 %) отличают наш подход от существующих аналогов.

Так, имеющиеся модели [16, 17] базируются преимущественно на клинических и ультразвуковых данных, тогда как наша модель включает молекулярно-генетические маркеры (микроРНК, факторы роста), что позволяет точнее оценить биологический потенциал ткани.

Таким образом, концепция, согласно которой рецидивирующие лейомиомы являются проявлением системной предрасположенности миометрия к опухолевой трансформации, активируемой хирургическим вмешательством, находит подтверждение в свете новейших данных о роли микроРНК и ангиогенных факторов [18–20]. Внедрение данной прогностической модели в клиническую практику позволит перейти к действительно персонализированному ведению пациенток репродуктивного возраста с ЛМ.

Заключение. Патогенетические механизмы рецидивов лейомиомы матки в репродуктивном возрасте после органосохраняющего лечения представляют собой сложный многоуровневый комплекс процессов, обуславливающих предрасположенность миометрия к опухолевой трансформации: на молекулярном уровне отмечается дисбаланс микроРНК (повышение экспрессии Let-7, miR-92a и снижение miR-146b), который, подавляя апоптоз, создает среду для неконтролируемого роста остаточных клеток после миомэктомии; на клеточном – гиперактивация ключевых факторов роста (TGF-β и VEGF); на тканевом – ги-алиноз, отек, несоответствие темпов роста и васкуляризации, фибриноидный некроз, что на органном уровне объясняет формирование крупных, быстрорастущих, множественных узлов, значительное увеличение матки, т.е. клинические проявления рецидивов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Карамян Р.А., Ордиянц И.М., Демура Т.А.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Карамян Р.А.,

Крот М.А., Рыженков К.В.

Статистическая обработка данных: Карамян Р.А., Мамыкин А.И.

Анализ и интерпретация данных: Ордиянц И.М., Демура Т.А., Мамыкин А.И.

Написание и редактирование текста: Карамян Р.А., Демура Т.А., Ордиянц И.М.